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Protein LoBind Tubes, Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless

蛋白LoBind离心管

公司名称: Eppendorf
产品编号: 022431081
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Preparation of Cell-free Synthesized Proteins Selectively Double Labeled for Single-molecule FRET Studies
Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract]  Single-molecule FRET (smFRET) is a powerful tool to investigate molecular structures and conformational changes of biological molecules. The technique requires protein samples that are site-specifically equipped with a pair of donor and acceptor fluorophores. Here, we present a detailed protocol for preparing double-labeled proteins for smFRET studies. The protocol describes two cell-free approaches to achieve a selective label scheme that allows the highest possible accuracy in inter‐dye distance determination. [摘要]  单分子FRET(smFRET)是研究生物分子的分子结构和构象变化的有力工具。 该技术需要蛋白质样品,该样品是特定位点配有一对供体和受体荧光团的。 在这里,我们提供了一个制备smFRET研究的双标记蛋白的详细方案。 该协议描述了两种无细胞方法来实现选择性标记方案,其允许在染料间距离确定中具有最高可能的准确性。

【背景】单分子FRET(smFRET)是结构生物学中最重要的工具之一,特别是用于分析蛋白质的结构和功能构象变化(Michalet等人,2006; Roy等人。,2008; Sustarsic和Kapanidis,2015)。然而,smFRET的广泛应用在许多情况下受限于合适的蛋白质样品的精细生产。这些蛋白质需要配备两个荧光团,位点特异性连接在蛋白质结构内的不同位置。

经典的基于细胞的蛋白质生产需要一系列耗时的步骤,可以通过使用无细胞蛋白质合成(CFPS)系统来克服,允许更快且直接地生产和选择适当的双标记蛋白质。此外,CFPS的另一个优点是由于几类蛋白质如蛋白酶或膜蛋白对活细胞或其他原因有毒,难以在细胞中表达,可以在CFPS系统中成功合成。最后,CFPS是专注于光谱技术如smFRET的实验室的理想工具,因为细胞培养不是必需的,并且不必考虑重组生物的安全规定。

尽管smFRET所需的样本量本质上很低,但迄今为止,在smFRET研究中,CFPS尚未被标准地用于生产样本。这主要是由于与基于细胞的系统相比蛋白质产量低得多,并且缺乏适当的无细胞方法,其允许适当量的双标记蛋白质的方便合成。然而,正如我们的小组所表明的那样,得益于更高效的正交标记方案(Sadoine ...

A Method for Extracting the Nuclear Scaffold from the Chromatin Network
Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract]  Each cell contains many large DNA polymers packed in a nucleus of approx. 10 μm in diameter. With histones, these DNA polymers are known to form chromatins. How chromatins further compact in the nucleus is unclear but it inevitably depends on an extensive non-chromatin nuclear scaffold. Imaging of endogenous chromatin network and the complementary scaffold that support this network has not been achieved but biochemical and proteomic investigations of the scaffold can still provide important insights into this chromatin-organizing network. However, this demands highly inclusive and ... [摘要]  每个细胞都含有许多大型DNA聚合物,其中包含大约一个核。直径10微米。用组蛋白,已知这些DNA聚合物形成染色质。染色质在核中如何进一步致密还不清楚,但它不可避免地依赖于广泛的非染色质核支架。内源性染色质网络的成像和支持该网络的互补支架尚未实现,但支架的生化和蛋白质组学研究仍然可以提供关于该染色质组织网络的重要见解。但是,这需要高度包容和可重复的提取核支架。我们最近开发了一个简单的协议,用于从染色质中释放脚手架组件。提取物的包容性由以下观察结果证实:当从核中提取时,剩余的核染色质被释放为延伸且通常平行的染色质纤维。基本上,该方案包括纯核的产生,用Triton X-100处理细胞核以产生包膜消耗的细胞核(TxN),并在含蔗糖的缓冲液中在500mM NaCl中提取细胞核。 TxN的这个组合提取被称为TxNE。

【背景】通过蛋白质和核糖核蛋白的复杂支架,染色质在细胞核中密集并动态地压缩。与细胞骨架网络不同(Fischer和Fowler,2015),对这种核支架的显微观察在技术上是具有挑战性的。这可能反映了每个细胞核内染色质的主导地位,支架与细胞核交织在一起。核的球形排列也对成像这种支架结构造成挑战。核支架的主要元素是核层(NL)(Gruenbaum和Foisner,2015)。 ...

Determining Ribosome Translational Status by Ribo-ELISA
Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract]  The Ribo-ELISA was originally developed to elucidate the basis for the ribopuromycylation method (RPM)-based detection of ribosome bound nascent chains. The Ribo-ELISA enables characterization of the translational status of ribosomes, and can be applied to the discovery of super-ribosomal complexes with novel ribosome associated macromolecules that are isolated by physical fractionation in sucrose gradients or other methods. [摘要]  Ribo-ELISA最初是为阐明基于核糖核苷酸化方法(RPM)的核糖体结合新生链检测的基础而开发的。 Ribo-ELISA能够表征核糖体的翻译状态,并且可以应用于通过蔗糖梯度中的物理分离或其他方法分离的新型核糖体相关大分子的超核糖体复合物的发现。

【背景】核糖体是由40S和60S亚单位组成的异构结构,当多个核糖体与单个mRNA结合时,它们以单体和多核糖体存在于细胞中。 另外,翻译核糖体可以与调节翻译的多个分子复合物相关联。 核糖体ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)能够通过核糖体相关新生链的体外嘌呤化检测翻译核糖体(David等人,2012)。 在将嘌呤霉素添加至具有结合的新生链的核糖体时,这种化学反应自发进行。 该方法定量测定每个核糖体中出现的新生链的数量,并且可以用于确定单核细胞相对于多核糖体的翻译状态,并鉴定结合其他大分子的核糖体,其改变其在沉淀柱中的沉降速率或迁移。

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