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T4 DNA Ligase

T4 DNA连接酶

公司名称: New England Biolabs
产品编号: M0202S
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Dual Fluorescence Reporter Based Analytical Flow Cytometry for miRNA Induced Regulation in Mammalian Cells
Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract]  MicroRNA-induced gene regulation is a growing field in basic and translational research. Examining this regulation directly in cells is necessary to validate high-throughput data originated from RNA sequencing technologies. For this several studies employ luciferase-based reporters that usually measure the whole cell population, which comes with low resolution for the complexity of the miRNA-induced regulation. Here, we provide a protocol using a dual-fluorescence reporter and flow cytometry reaching single cell resolution; the protocol contains a simplified workflow that includes: vector ... [摘要]  MicroRNA诱导的基因调控是基础和转化研究中不断增长的领域。 直接在细胞中检查该调节对于验证源自RNA测序技术的高通量数据是必要的。 对于这一研究,一些研究采用基于荧光素酶的报告基因,通常测量全细胞群,其具有低分辨率的miRNA诱导调节的复杂性。 在这里,我们提供使用双荧光报告基因和流式细胞仪达到单细胞分辨率的方案; 该协议包含一个简化的工作流程,包括:使用R环境进行矢量生成,数据采集,处理和分析。 我们的协议可实现miRNA诱导的转录后基因调控的高分辨率测量,并结合系统生物学,可用于估计miRNA的熟练程度。

【背景】MicroRNAs(miRNA)是高度保守的小型非蛋白质编码RNA(21-22nt),可调节转录后基因表达并调节基因生物学过程,如发育和细胞稳态(Lagos-Quintana et al。,2001; Fabian et al。,2010; Bartel,2018),包括miRNA表达与肿瘤进展和侵袭性相关的几种病理(Lu et al。, 2005; Di Leva和Croce,2013; Krishnan et al。,2015; Bertoli et ...

Delivery of the Cas9 or TevCas9 System into Phaeodactylum tricornutum via Conjugation of Plasmids from a Bacterial Donor
Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract]  Diatoms are an ecologically important group of eukaryotic microalgae with properties that make them attractive for biotechnological applications such as biofuels, foods, cosmetics and pharmaceuticals. Phaeodactylum tricornutum is a model diatom with defined culture conditions, but routine genetic manipulations are hindered by a lack of simple and robust genetic tools. One obstacle to efficient engineering of P. tricornutum is that the current selection methods for P. tricornutum transformants depend on the use of a limited number of antibiotic resistance genes. An ... [摘要]  硅藻是一种具有重要生态意义的真核微藻类,其特性使其对生物燃料,食品,化妆品和药品等生物技术应用具有吸引力。 Phaeodactylum tricornutum 是具有确定培养条件的模型硅藻,但缺乏简单而强大的遗传工具阻碍了常规遗传操作。有效设计 P的一个障碍。 tricornutum 是 P的当前选择方法。 tricornutum 转化体依赖于使用有限数量的抗生素抗性基因。另一种更具成本效益的选择方法是产生 P的营养缺陷型菌株。通过敲除参与氨基酸生物合成的关键基因,并使用基于质粒的生物合成基因拷贝作为选择标记,使三角酵母。以前关于 P基因敲除的研究。 tricornutum 使用biolistic转换将CRISPR-Cas9系统传递到 P.藻。非复制质粒的生物射弹转化可导致对 P的不期望的损伤。由于转化的DNA随机整合到基因组中,tricornutum 。随后固化编辑的细胞以防止Cas9的长期过表达是非常困难的,因为目前没有方法来切除整合的质粒。该协议采用新方法将Cas9或TevCas9系统传送到 P. tricornutum 通过来自细菌供体细胞的质粒的缀合。该过程涉及:1)设计和插入靶向 P的guideRNA。将tricornutum 尿素酶基因导入TevCas9表达质粒,该质粒也编码转移的接合起点,2)将该质粒安装在含有含有接合机制的质粒(pTA-Mob)的大肠杆菌中, ...

Characterization of Protein Domain Function via in vitro DNA Shuffling
Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract]  We recently investigated the molecular events that drive evolution of the CTX-M-type β-lactamases by DNA shuffling of fragments of the blaCTX-M-14 and blaCTX-M-15 genes. Analysis of a total of 51 hybrid enzymes showed that enzymatic activity could be maintained in most cases, yet the enzymatically active hybrids were found to possess much fewer amino acid substitutions than the few hybrids that became inactive, suggesting that point mutations in the constructs rather than reshuffling of the fragments of the two target genes would more likely cause ... [摘要]  我们最近研究了通过对CTX-M-14和EMX-M-14的片段进行DNA改组来驱动CTX-M型β-内酰胺酶进化的分子事件, bla CTX-M-15基因。 总共51种杂合酶的分析显示酶活性在大多数情况下可以保持,但是酶活性杂合体被发现比少数杂交体具有少得多的氨基酸取代,这表明构建体中的点突变而不是 两个靶基因片段的重新洗牌将更可能导致CTX-M活性的破坏。 确定了一些在介导酶活性中起重要作用的重要残基。 这些发现表明,DNA改组是一种有效的方法来鉴定和表征细菌蛋白质中的重要功能结构域。

【背景】DNA重组是一种自然过程,通过该过程,细菌之间交换遗传物质以增强环境压力下的生存适应性。几种杂交CTX-M-内酰胺酶(CTX-M-64,CTX-M-123,CTX-M-137和CTX-M-132)可能是由bla CTX-M-14和 bla CTX-M-15基因是世界上最常见的变异体,近年来已有报道(Nagano et al。 ,2009; Tian et al。,2014; He et al。,2015; Liu et。, 2015年)。在这些杂合酶中,包含CTX-M-15的N-和C-末端部分和CTX-M-14的中间片段的CTX-M-64显示出比其亲本原型更高的催化活性(He <等)。,2015)。

DNA改组是一种分子途径,被设计为通过PCR介导的两种靶基因的随机组合来模拟和加速进化过程(Crameri ...

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