Analyses of Root-secreted Acid Phosphatase Activity in Arabidopsis
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Date:
2017-04-05
[Abstract] Induction and secretion of acid phosphatase (APase) is a universal adaptive response of higher plants to low-phosphate stress (Tran et al., 2010). The intracellular APases are likely involved in the remobilization and recycling of phosphate (Pi) from intracellular Pi reserves, whereas the extracellular or secreted APases are believed to release Pi from organophosphate compounds in the rhizosphere. The phosphate starvation-induced secreted APases can be released into the rhizosphere or retained on root surfaces (root-associated APases). In this article, we describe the protocols for ...
[摘要] 酸性磷酸酶(APase)的诱导和分泌是高等植物对低磷酸盐胁迫的普遍适应性反应(Tran et al。,2010)。细胞内APase可能参与磷酸盐(Pi)从细胞内Pi储备的再利用和再循环,而细胞外或分泌的APase被认为从根际中的有机磷酸盐化合物中释放出Pi。磷酸盐饥饿诱导的分泌的APase可以释放到根际中或保留在根表面(根相关的APase)上。在本文中,我们描述了在拟南芥(Arabidopsis thaliana)(拟南芥)中分析根分泌的APase活性的方案。在拟南芥中,释放到根际的根系相关APase和APase的活性可以基于它们切割合成底物,释放黄色产物的对硝基苯基磷酸(pNPP)的能力来定量,对硝基苯酚(pNP)(Wang等,2011和2104)。根系相关的APase活性也可以通过将显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基 - 磷酸酯(BCIP)施用到根表面来直接显现(Lloyd等人,2001; Tomscha et al。 ,2004; Wang等人,2011和2014),而释放到根际中的APase的同功酶可以使用凝胶内测定法(Trull和Deikman,1998; Tomscha等人,2004; Wang等人, 2011年和2014年)。之前已经描述了用于分析拟南芥细胞内APase活性的方案(Vicki和William,2013)。 【背景】磷酸盐(Pi)是植物通过根系发生磷的主要形式,大多数土壤中的Pi水平较低,导致Pi饿。为了应对这种营养压力,植物引发了一系列适应性反应,增加了其生存和增长。 ...
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Differential Salt Fractionation of Nuclei to Analyze Chromatin-associated Proteins from Cultured Mammalian Cells
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Nucleosomes are the core units of cellular chromatin and are comprised of 147 base pairs (bp) of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Proteins such as chromatin remodelers, transcription factors, and DNA repair proteins interact dynamically with chromatin to regulate access to DNA, control gene transcription, and maintain genome integrity. The extent of association with chromatin changes rapidly in response to stresses, such as immune activation, oxidative stress, or viral infection, resulting in downstream effects on chromatin conformation and transcription of target genes. To ...
[摘要] 核小体是细胞染色质的核心单元,由包裹在组蛋白的八聚体周围的147个碱基对(bp)的DNA组成。蛋白质如染色质重组体,转录因子和DNA修复蛋白质与染色质动态相互作用以调控DNA的接触,控制基因转录和维持基因组完整性。与染色质结合的程度响应于诸如免疫激活,氧化应激或病毒感染等应激而迅速变化,导致对染色质构象和靶基因转录的下游作用。为了阐明在不同条件下与染色质相关蛋白质组成的变化,我们调整了现有的方案来分离核,并使用盐浓度的梯度分离细胞染色质。可以通过蛋白质印迹或质谱法评估不同盐部分中特定蛋白质的存在,从而了解与染色质相关的程度。
背景 由于与DNA或组蛋白的电荷相互作用,许多染色质相关蛋白在低盐条件下是不溶的。由于盐破坏了基于电荷的蛋白质DNA和蛋白质 - 蛋白质的相互作用,染色质相关蛋白质随着NaCl浓度的增加而变得更加可溶(Teves和Henikoff,2012)。与DNA强烈结合的蛋白质预期用高盐洗脱,而松散结合的蛋白质(例如转录因子)将用低盐洗脱。我们特别关心病毒感染如何改变与细胞染色质相关的因素的组成。核复制病毒,例如腺病毒,单纯疱疹病毒和爱泼斯坦 - 巴尔病毒,可以显着改变感染期间宿主染色质的出现(Avgousti等人,2016; Lam等人, ,2010; Simpson-Holley等人,2005; ...
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Highly Accurate Real-time Measurement of Rapid Hydrogen-peroxide Dynamics in Fungi
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] Reactive oxygen species (ROS) are unavoidable by-products of aerobic metabolism. Despite beneficial aspects as a signaling molecule, ROS are principally recognized as harmful agents that act on nucleic acids, proteins and lipids. Reactive oxygen species, and, in particular, hydrogen peroxide (H2O2), are deployed as defense molecules across kingdoms, e.g., by plants in order to defeat invading pathogens like fungi. Necrotrophic plant pathogenic fungi themselves secrete H2O2 to induce host cell death and facilitate infection. Hydrogen ...
[摘要] 活性氧(ROS)是有氧代谢的副产物。尽管作为信号分子的有利方面,ROS主要被认为是作用于核酸,蛋白质和脂质的有害物质。反应性氧物质,特别是过氧化氢(H 2 O 2 O 2),作为防御分子跨越诸如,通过植物为了击败入侵病原体如真菌。营养不良的植物致病真菌本身分泌H 2 O 2 O 2以诱导宿主细胞死亡并促进感染。过氧化氢在一定程度上可以通过膜自由扩散。为了能够监测真菌中的细胞内过氧化氢动力学,我们最近在丝状植物病原体禾谷镰刀菌(Mentges and Bormann,2015)中建立了多功能的HyPer成像技术。 HyPer由插入到原核H 2 O 2 O 2 - 感觉蛋白OxyR的调节结构域(RD)中的循环置换的黄色荧光蛋白(cpYFP)组成。 OxyR域使传感器高度特异于H 2 O 2 O 2。 HyPer的氧化增加了在488nm激发的cpYFP的荧光,并降低了在405nm激发的荧光,从而促进了比例式读数(Belousov等人,2006)。 HyPer原来是对pH敏感。 HyPer的H 2 O 2 O 2 - 感官域中的单个氨基酸突变使传感器对H 2 O 2不敏感。该记者称为SypHer,作为pH变化的对照。    通过使用HyPer成像技术,我们可以证明:i)HyPer成像能够特异和准确地检测细胞内H 2 O 2 O 2平衡的快速变化,ii)。 ...
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