| Expression, Purification and Crystallization of Recombinant Arabidopsis Monogalactosyldiacylglycerol Synthase (MGD1)
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] In plant cells, galactolipids are predominant, representing up to 50% of the lipid content in photosynthetic tissues. Galactolipid synthesis is initiated by MGDG synthases (MGDs), which use UDP-galactose as a donor sugar and diacylglycerol (DAG) as acceptor, to form monogalactosyldiacylglycerol (MGDG). This protocol is used to produce a recombinant form of Arabidopsis thaliana (A. thaliana) monogalactosyldiacylglycerol synthase 1 (MGD1) protein, in Escherichia coli (E. coli), using a two-step chromatographic purification procedure. The protein is easily ...
[摘要] 在植物细胞中，半乳糖脂是主要的，代表高达光合组织脂质含量的50％。通过使用UDP-半乳糖作为供体糖和二酰基甘油（DAG）作为受体的MGDG合成酶（MGD）启动半乳糖脂合成以形成单糖基二酰基甘油（MGDG）。该方案用于在大肠杆菌中产生拟南芥（Arabidopsis thaliana）（拟南芥）单糖半乳糖二酰基甘油合酶1（MGD1）蛋白的重组形式（大肠杆菌），使用两步色谱纯化方法。蛋白质容易表达和纯化至数量，适用于生物化学和结构研究。还描述了MGD1的结晶。
背景 以前在e中表达植物MGD的尝试。大肠杆菌显示约99％的重组蛋白质积累在包涵体中（Miège等，1999）。开发了使用洗涤剂或体外包涵体折叠方案的细菌膜的溶解，并产生足够的纯和活性级分，足以监测酶的活性，但不进行其结构研究（Nishiyama et ...
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| In vitro Deneddylation Assay
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Author:
Date:
2016-03-20
[Abstract] Nedd8 is a small ubiquitin-like protein (9 kDa) covalently attached to a conserved lysine residue of a cullin protein which is part of cullin-RING ligases (CRLs). CRLs are major E3 ligases important for protein ubiquitination in the ubiquitin-proteasome pathway (UPP). The activity of CRLs is regulated by cycles of neddylation (CulA-N8, ~98 kDa) and deneddylation (CulA ~89 kDa). The COP9 signalosome (CSN) and Deneddylase A (DenA) are capable of cleaving the isopeptide bond between Nedd8 and CullinA. In contrast to the single protein DenA, CSN is an eight subunit multiprotein complex. Protein ...
[摘要] Nedd8是共价连接到作为cullin-RING连接酶（CRL）的一部分的cullin蛋白的保守赖氨酸残基的小的遍在蛋白样蛋白（9kDa）。 CRL是对泛素 - 蛋白酶体途径（UPP）中的蛋白质泛素化重要的主要E3连接酶。 CRL的活性通过脱甲基化（CulA-N8，〜98kDa）和脱甲基化（CulA〜89kDa）的循环调节。 COP9信号体（CSN）和丁二酸酶A（DenA）能够切割Nedd8和CullinA之间的异肽键。与单一蛋白DenA相反，CSN是八亚基多蛋白复合物。将不同的构巢曲霉csn 缺失菌株的蛋白质粗提物与从大肠杆菌（大肠杆菌）表达和纯化的重组CSN亚基混合。使用抗CulA或抗Nedd8抗体的Western杂交实验可以显示Nedd化化合物与Denedd化CulA的比率。使用deneddylation测定，我们可以显示CsnE是在体外连接7-亚基预组装的CSN的最后一个亚基，然后CSN可以通过金属蛋白酶亚基CsnE执行cullin deneddylation。该测定法是一种快速且非昂贵的方法，其显现了用于脱蛋白的蛋白质的酶活性。它还可用于测试除去来自构巢曲霉（构巢曲霉）或其他生物体中的底物的翻译后修饰的其它藻肽的活性。
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