| Mating Based Split-ubiquitin Assay for Detection of Protein Interactions
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] The mating based split-ubiquitin (mbSUS) assay is an alternative method to the classical yeast two-hybrid system with a number of advantages. The mbSUS assay relies on the ubiquitin-degradation pathway as a sensor for protein-protein interactions, and it is suitable for the determination of interactions between full-length proteins that are cytosolic or membrane-bound. Here we describe the mbSUS assay protocol which has been used for detecting the interaction between K+ channel and SNARE proteins (Grefen et al., 2010 and 2015; Zhang et al., 2015 and 2016)
[摘要] 基于交配的分ubiquitin（mbSUS）测定是具有许多优点的经典酵母双杂交系统的替代方法。 mbSUS测定依赖于泛素降解途径作为蛋白质 - 蛋白质相互作用的传感器，并且它适用于测定细胞溶质或膜结合的全长蛋白质之间的相互作用。在这里，我们描述了已经用于检测K + 通道和SNARE蛋白之间的相互作用的mbSUS测定方案（Grefen等人，2010和2015; Zhang 等等，2015和2016）
背景 图1是mbSUS测定的概况。泛素部分被分成两半，N末端半突变（NubG）以避免重组。泛素部分（Cub）的C末端一半与转录报告基因复合物PLV（Protein A-LexA-VP16）连接。两种蛋白质（X和Y）分别与NubG和CubPLV融合产生蛋白质 - 蛋白质相互作用分析系统。转化后，酵母菌株THY.AP5含有NubG-X融合蛋白，而酵母菌株THY.AP4含有Y-CubPLV融合蛋白。在交配后，在二倍体酵母中，如果蛋白质X和Y彼此相互作用，则将重新组装功能性泛素，这导致PLV的切割。释放的转录蛋白复合物PLV可以开启报告基因（ADE2，HIS3），并允许酵母生长在选择性培养基上。
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| In vitro Deneddylation Assay
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Author:
Date:
2016-03-20
[Abstract] Nedd8 is a small ubiquitin-like protein (9 kDa) covalently attached to a conserved lysine residue of a cullin protein which is part of cullin-RING ligases (CRLs). CRLs are major E3 ligases important for protein ubiquitination in the ubiquitin-proteasome pathway (UPP). The activity of CRLs is regulated by cycles of neddylation (CulA-N8, ~98 kDa) and deneddylation (CulA ~89 kDa). The COP9 signalosome (CSN) and Deneddylase A (DenA) are capable of cleaving the isopeptide bond between Nedd8 and CullinA. In contrast to the single protein DenA, CSN is an eight subunit multiprotein complex. Protein ...
[摘要] Nedd8是共价连接到作为cullin-RING连接酶（CRL）的一部分的cullin蛋白的保守赖氨酸残基的小的遍在蛋白样蛋白（9kDa）。 CRL是对泛素 - 蛋白酶体途径（UPP）中的蛋白质泛素化重要的主要E3连接酶。 CRL的活性通过脱甲基化（CulA-N8，〜98kDa）和脱甲基化（CulA〜89kDa）的循环调节。 COP9信号体（CSN）和丁二酸酶A（DenA）能够切割Nedd8和CullinA之间的异肽键。与单一蛋白DenA相反，CSN是八亚基多蛋白复合物。将不同的构巢曲霉csn 缺失菌株的蛋白质粗提物与从大肠杆菌（大肠杆菌）表达和纯化的重组CSN亚基混合。使用抗CulA或抗Nedd8抗体的Western杂交实验可以显示Nedd化化合物与Denedd化CulA的比率。使用deneddylation测定，我们可以显示CsnE是在体外连接7-亚基预组装的CSN的最后一个亚基，然后CSN可以通过金属蛋白酶亚基CsnE执行cullin deneddylation。该测定法是一种快速且非昂贵的方法，其显现了用于脱蛋白的蛋白质的酶活性。它还可用于测试除去来自构巢曲霉（构巢曲霉）或其他生物体中的底物的翻译后修饰的其它藻肽的活性。
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