| Production, Purification and Characterization of Recombinant Biotinylated Phytochrome B for Extracellular Optogenetics
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] In the field of extracellular optogenetics, photoreceptors are applied outside of cells to obtain systems with a desired functionality. Among the diverse applied photoreceptors, phytochromes are the only ones that can be actively and reversibly switched between the active and inactive photostate by the illumination with cell-compatible red and far-red light. In this protocol, we describe the production of a biotinylated variant of the photosensory domain of A. thaliana phytochrome B (PhyB-AviTag) in E. coli with a single, optimized expression plasmid. We give detailed ...
[摘要] [摘要 ] 在细胞外光遗传学领域，光感受器被应用于细胞外，以获得具有所需功能的系统。在各种应用的感光体中，植物色素是唯一可以通过与细胞相容的红色和远红外光照射而在活性和非活性光态之间主动和可逆地切换的色素。在此协议中，我们描述了在大肠杆菌中拟南芥光敏色素B（PhyB-AviTag ）的光敏域的生物素化变体的生产。 带有一个优化的表达质粒。我们给出了通过固定的金属亲和色谱法纯化蛋白质的详细说明，并根据纯度，生物素化，光谱光开关以及与它的相互作用伴侣PIF6的光依赖性相互作用对蛋白质进行了表征。与以前使用PhyB-AviTag 进行的研究相比，此方案中使用的优化表达质粒简化了生产过程，并显示出更高的产量和纯度。
[背景 ] 在新兴的细胞外光遗传学领域，光感受器被应用于细胞外，例如，以控制生物功能或设计光响应性生物材料（Leung 等，2008；Zhang 等，2015；Chen and Wegner ，2017 ; Lyu 等人，2017 ; Wang 等人，2017 ; Bartelt 等人，2018 ; Beyer 等人，2018a ; Beyer 等人，2018b ; Jia 等人，2018 ; Kolar 等人， 2018 ; Liu 等人，2018 ; Wu 等人，2018 ; Baaske 等人，2019 ; Gil 等人，2019 ; H?rner ...
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| zPACT: Tissue Clearing and Immunohistochemistry on Juvenile Zebrafish Brain
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Author:
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2017-12-05
[Abstract] In studies of brain function, it is essential to understand the underlying neuro-architecture. Very young zebrafish larvae are widely used for neuroarchitecture studies, due to their size and natural transparency. However, this model system has several limitations, due to the immaturity, high rates of development and limited behavioral repertoire of the animals used.
We describe here a modified version of the passive clearing technique (PACT) (Chung et al., 2013; Tomer et al., 2014; Yang et al., 2014; Treweek et al., 2015), which facilitates ...
[摘要] 在脑功能研究中，了解潜在的神经结构是至关重要的。非常年轻的斑马鱼幼虫被广泛用于神经构造研究，由于它们的大小和自然透明度。然而，这个模型系统有一些局限性，由于使用的动物不成熟，发育率高，行为表现有限。
我们在这里描述了被动清除技术（PACT）的改进版本（Chung等人，2013; Tomer等人，2014; Yang等人， ，2014; Treweek et。，2015），这有助于大型水生物种标本的神经解剖学研究。这种方法最初是为斑马鱼（2017年）开发的（ Danio rerio ）（2017年;Frétaud等人，2017年; Mayrhofer等人，2017年; Xavier “）等人，2017），但也已经成功地在其他鱼类上进行了测试，如鲭鱼（Oryzias latipes ）（Dambroise et al。，2017 ），墨西哥洞穴鱼（ Astyanax mexicaus ）和非洲斑马鱼（metriaclima zebra ）以及其他水生物种，如非洲爪蟾属。 （非洲爪蟾热带非洲爪蟾）（Fini等人，2017）。该协议基于由Deisseroth实验室等开发和修改的CLARITY方法（Chung等人，2013; Tomer等人，2014; Yang等人，2014），适用于水生物种，特别是斑马鱼（zPACT）。
该协议旨在通过在聚丙烯酰胺/甲醛网状物中交联来保持组织的整体结构，使斑马鱼标本光学透明。然后通过SDS处理除去存在于样品中的大部分脂质，通过消除导致不透明的水/脂质界面处的光散射来均化样品的折射率。最后的清除步骤包括将样品在基于果糖的固定介质（衍生自SeeDB）（Ke等人，2013）中孵育，其折射率与物镜的折射率相匹配的显微镜。该技术与使用绿色荧光蛋白（GFP）在特定细胞群体中表达的转基因斑马鱼的组合提供了描述其他技术不可见的解剖细节的机会。 ...
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| In vitro Deneddylation Assay
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Date:
2016-03-20
[Abstract] Nedd8 is a small ubiquitin-like protein (9 kDa) covalently attached to a conserved lysine residue of a cullin protein which is part of cullin-RING ligases (CRLs). CRLs are major E3 ligases important for protein ubiquitination in the ubiquitin-proteasome pathway (UPP). The activity of CRLs is regulated by cycles of neddylation (CulA-N8, ~98 kDa) and deneddylation (CulA ~89 kDa). The COP9 signalosome (CSN) and Deneddylase A (DenA) are capable of cleaving the isopeptide bond between Nedd8 and CullinA. In contrast to the single protein DenA, CSN is an eight subunit multiprotein complex. Protein ...
[摘要] Nedd8是共价连接到作为cullin-RING连接酶（CRL）的一部分的cullin蛋白的保守赖氨酸残基的小的遍在蛋白样蛋白（9kDa）。 CRL是对泛素 - 蛋白酶体途径（UPP）中的蛋白质泛素化重要的主要E3连接酶。 CRL的活性通过脱甲基化（CulA-N8，〜98kDa）和脱甲基化（CulA〜89kDa）的循环调节。 COP9信号体（CSN）和丁二酸酶A（DenA）能够切割Nedd8和CullinA之间的异肽键。与单一蛋白DenA相反，CSN是八亚基多蛋白复合物。将不同的构巢曲霉csn 缺失菌株的蛋白质粗提物与从大肠杆菌（大肠杆菌）表达和纯化的重组CSN亚基混合。使用抗CulA或抗Nedd8抗体的Western杂交实验可以显示Nedd化化合物与Denedd化CulA的比率。使用deneddylation测定，我们可以显示CsnE是在体外连接7-亚基预组装的CSN的最后一个亚基，然后CSN可以通过金属蛋白酶亚基CsnE执行cullin deneddylation。该测定法是一种快速且非昂贵的方法，其显现了用于脱蛋白的蛋白质的酶活性。它还可用于测试除去来自构巢曲霉（构巢曲霉）或其他生物体中的底物的翻译后修饰的其它藻肽的活性。
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