| Notch Ligand Binding Assay Using Flow Cytometry
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Notch signaling is an evolutionarily conserved signaling pathway that plays an indispensable role during development, and in the maintenance of homeostatic processes, in a wide variety of tissues (Kopan, 2012; Hori et al., 2013). The multifaceted roles of Notch signaling are stringently regulated at different levels. One of the most important aspects of regulation is the binding of different Notch ligands to each Notch receptor (NOTCH1-NOTCH4). Canonical ligands Delta or Serrate (in Drosophila), and Delta-like (DLL1 and DLL4) or Jagged (JAG1 and JAG2) (in mammals), are ...
[摘要] Notch信号传导是进化上保守的信号传导途径，在发育过程中以及在各种组织中维持体内平衡过程中起着不可或缺的作用（Kopan，2012; Hori等人，2013）。 Notch信号的多方面作用在不同的层面上受到严格的调控。监管的最重要的方面之一是不同Notch配体与各Notch受体（NOTCH1-NOTCH4）的结合。典型的配体Delta或Serrate（在果蝇中）和Delta样（DLL1和DLL4）或Jagged（JAG1和JAG2）（在哺乳动物中）是跨膜糖蛋白。在一个细胞上表达的配体结合相邻细胞上的Notch受体以诱导Notch信号传导。通过O-岩藻糖和O-GlcNAc聚糖对Notch受体细胞外结构域的糖基化作为Notch信号强度的关键调节剂已经得到很好的确立（Stanley and Okajima，2010; Haltom and Jafar-Nejad，2015; Sawaguchi et al。 >，2017）。为了表征Notch配体与分离细胞中的Notch受体的结合，我们利用人Fc区在C端标记的Notch配体胞外结构域，并通过流式细胞术确定荧光抗Fc抗体的结合。
【背景】众所周知，细胞增殖，分化和凋亡受Notch信号调节。 ...
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| [2-3H]Mannose-labeling and Analysis of N-linked Oligosaccharides
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] Modifications of N-linked oligosaccharides of glycoproteins soon after their biosynthesis correlate to glycoprotein folding status. These alterations can be detected in a sensitive way by pulse-chase analysis of [2-3H]mannose-labeled glycoproteins, with enzymatic removal of labeled N-glycans, separation according to size by HPLC and radioactive detection in a scintillation counter.
[摘要] 其生物合成后不久，糖蛋白的N-连接寡糖的修饰与糖蛋白折叠状态相关。 可以通过脉冲追踪分析[2- 3 H]甘露糖标记的糖蛋白，通过酶切除标记的N-聚糖来检测这些变化，根据大小通过HPLC分离和放射性 在闪烁计数器中检测。
【背景】在将新生多肽进入ER后，进行若干翻译后修饰，这对于折叠，成熟和质量控制过程至关重要。加入核糖寡糖Glc 3 N 3 GlcNAc 2以产生N-连接的糖蛋白是非常常见的修饰，首先发生（Benyair等人，2011）。前体N-聚糖的加工通过在早期分泌室（Tannous等人，2015）中创建识别标签来引导糖蛋白成熟和质量控制机制。在后期阶段，在整个分泌途径中，寡糖的核心作为将糖链扩展成复合聚糖的平台，其结构涉及糖蛋白的运输和功能（Kamiya等人， ，2012）。由于早期N-连接的聚糖修饰反映糖蛋白生物合成和质量控制，寡糖加工已成为许多研究的主题（Avezov等人，2010; Hosokawa等人。，2010; Ninagawa等人，2014; Ogen-Shtern等人，2016）。糖蛋白组学方法大大改善了N-聚糖的表征，但它们不允许研究早期分泌途径中聚糖加工的动力学。
＆NBSP;这里我们描述一种用于分离和分析代谢标记的N-连接寡糖的简化脉冲追踪方法。该方法包括通过[2- H] ...
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| Conjugation of Duplexed siRNN Oligonucleotides with DD-HyNic Peptides for Cellular Delivery of RNAi Triggers
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Author:
Date:
2016-04-05
[Abstract] Despite the great promise that short interfering RNA (siRNA) induced RNAi responses hold as a therapeutic modality, due to their size (~15 kDa) and high negative charge (Bumcrot et al., 2006), siRNAs have no bioavailability and require a delivery agent to enter cells (Figure 1). TAT peptide transduction domain (PTD) has been developed as an agent that mediates cellular delivery of macromolecular therapeutics that otherwise lack bioavailability, making it a tantalizing candidate for siRNA delivery (Farkhani et al., 2014). Unfortunately, when conjugated to TAT PTD, the ...
[摘要] 尽管由于它们的大小（〜15kDa）和高负电荷（Bumcrot等人，2006），短干扰RNA（siRNA）诱导的RNAi反应保持作为治疗模式的巨大希望，siRNA没有生物利用度，需要递送剂进入细胞（图1）。 TAT肽转导结构域（PTD）已经被开发为介导大分子治疗剂的细胞递送的药剂，否则其缺乏生物利用度，使其成为siRNA递送的诱人候选物（Farkhani等人，2014）。不幸的是，当缀合到TAT PTD时，siRNA上40个负磷酸二酯主链电荷的存在中和了导致聚集和差的细胞递送的阳离子PTD（Meade和Dowdy，2007）。鉴于此，我们合成了称为siRibo核中性的中性RNAi触发物，用于与TAT PTD缀合（Meade等人，2014）。简言之，带负电荷的磷酸二酯主链通过具有生物可逆磷酸三酯保护基团的合成来中和，其通过细胞质限制性硫酯酶的作用特异性地转化为细胞内的带电磷酸二酯键，产生可诱导RNAi应答的野生型siRNA。在这里我们描述了与TAT PTD递送结构域（DD）HyNic肽的siRNN寡核苷酸的缀合和细胞递送。
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