| Induction of Epithelial-mesenchymal Transition in MDCK II Cells
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a reversible process of epithelial cell transdifferentiation into a mesenchymal cell, that enables initiation of cell migration. EMT plays an important role in embryonic development, tissue repair and cancer metastasis. Better understanding of cellular and molecular events during EMT will not only provide novel insights on how mammalian organism develops and how epithelial tissues regenerate, but also can identify novel therapeutic targets for cancer therapy. Here we aim to provide a detailed protocol on how to induce EMT in Madin-Darby Canine Kidney ...
[摘要] [摘要]上皮-间质转化（EMT）是上皮细胞向分化为间充质细胞的可逆过程，能够启动细胞迁移。EMT在胚胎发育，组织修复和癌症转移中起着重要作用。更好地了解EMT过程中的细胞和分子事件，不仅将为哺乳动物生物的发育以及上皮组织的再生提供新颖的见解，而且还可为癌症治疗确定新的治疗靶标。在这里，我们旨在提供有关如何在Madin-Darby犬肾脏（MDCK）II上皮细胞系中诱导EMT并在EMT诱导的细胞上进行免疫荧光染色的详细协议。
[背景]上皮细胞的特征在于细胞可塑性，即具有采用不同细胞表型的能力（Carter等，2019； Yuan等，2019）。上皮-间质转化（EMT）是上皮细胞可塑性的一种形式。在EMT期间，上皮细胞会破坏细胞间连接，使其极性失去作用，并从鳞状，长方体或柱状变为梭形并迁移，从而获得间充质细胞的特性（Kalluri和Weinberg，2009）。EMT可以通过免疫染色和测量标志物（例如E-钙粘蛋白，ZO-1，波形蛋白，纤连蛋白和N-钙粘蛋白）的表达水平进行评估（Kalluri和Weinberg，2009）。在过去十年中在EMT研究中心大多的转录因子的作用例如，SNAIL1 / 2，ZEB1 / ...
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| Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) Assay for Determination of Molecular Interactions in Living Cells
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] The bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assay can be used as an indicator of molecular approximation and/or interaction. A significant resonance energy transfer signal is generated when the acceptor, having the appropriate spectral overlap with the donor emission, is approximated with the donor. In the example provided, proteins tagged with bioluminescent Renilla luciferase (Rlu) as donor and yellow fluorescent protein (YFP) as acceptor were co-expressed in cells. This pair of donor and acceptor have an approximate Förster distance of 4.4 nm, providing the optimal ...
[摘要] 生物发光共振能量转移（BRET）测定可以用作分子近似和/或相互作用的指标。 当具有与供体发射的适当光谱重叠的受体与供体近似时，产生显着的共振能量转移信号。 在所提供的例子中，用生物发光的海肾荧光素酶（Rlu）作为供体和作为受体的黄色荧光蛋白（YFP）标记的蛋白在细胞中共表达。 这对供体和受体具有4.4nm的近似Forster距离，提供了最佳的工作距离（Dacres et。，2010）。 这种技术可以用来探索在活细胞中发生的特定分子相互作用的时间过程。
【背景】使用生物发光供体和荧光受体的生物发光共振能量转移（BRET）研究可以监测在活细胞中实时发生的分子相互作用（例如标记的蛋白质，肽或小分子之间）。这种方法取决于供体和受体之间的空间近似，以及适当的光谱重叠以产生有意义的信号（图1）。目前提供的实例使用Rlu-标记的蛋白质作为供体和YFP-标记的蛋白质作为受体（Harikumar等人，2007）。这已被非常成功地应用于建立活细胞质膜中生理相关的蛋白质 - 蛋白质相互作用的存在。然而，重要的是包括可能导致非特异性蛋白质 - 蛋白质近似和能量转移（旁观者效应）的表达水平的对照，例如使用相似水平的已知非相关蛋白质的表达。此外，与未标记蛋白质的竞争可以帮助建立信号的相互作用的可饱和性和特异性。
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| Uptake Assays to Monitor Anthracyclines Entry into Mammalian Cells
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Anthracyclines, such as doxorubicin and daunorubicin, are DNA damaging agents that autofluoresce and can be readily detected in cells. Herein, we developed suitable assays to quantify and localize daunorubicin in mammalian cells. These assays can be exploited to identify components that are involved in the uptake of anthracyclines.
[摘要] 蒽环类药物，如多柔比星和柔红霉素，是DNA损伤剂，其可自发荧光并且可以容易地在细胞中检测到。 在这里，我们开发了合适的测定法来定量和定位哺乳动物细胞中的柔红霉素。 可以利用这些测定来鉴定参与蒽环类药物吸收的成分。
【背景】蒽环类药物，如多柔比星和柔红霉素，通过损伤DNA起作用，用于治疗各种类型的癌症，包括急性骨髓性白血病。当癌症患者被系统地给予蒽环类抗生素时，有几个因素限制了到达肿瘤部位的药物的量（Chauncey，2001; Deng等，2014; Riganti等，2015）。在肿瘤中，对癌细胞的药物活性受到药物吸收不良，药物流出过量以及细胞靶标变化的限制。几十年来，这些DNA损伤剂如何进入癌细胞还不清楚（Aouida等，2010; Cesar-Razquin等，2015; Zhang等，2015）。为了解决这个问题，我们开发了三种可靠的体外测定法来监测柔红霉素在细胞中的积累。这些测定中的两个是定量的，需要获得荧光活化细胞分选（FACS）口径和Fluoroskan仪器，第三个是使用落射荧光显微镜进行半定量。使用这些测定法，我们确定柔红霉素以时间和浓度依赖的方式进入细胞，并且每种细胞类型显示不同的摄取速率，这表明活性过程参与蒽环类药物的摄入（Andreev等人， ...
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