Immunoprecipitation of Cell Surface Proteins from Gram-negative Bacteria
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] The meningococcus (Neisseria meningitidis) remains an important threat to human health worldwide. This Gram-negative bacterium causes elevated disabilities and mortality in infected individuals. Despite several available vaccines, currently there is no universal vaccine against all circulating meningococcal strains (Vogel et al., 2013). Herein, we describe a new protocol that is capable of identifying only cell surface exposed proteins that play a role in immunity, providing this research field with a more straightforward approach to identify novel vaccine targets. Even ...
[摘要] 脑膜炎球菌(脑膜炎奈瑟氏球菌)仍然是全球人类健康的重大威胁。这种革兰氏阴性细菌导致感染个体的残疾和死亡率升高。尽管有几种可用的疫苗,目前还没有针对所有循环脑膜炎球菌菌株的通用疫苗(Vogel等人,2013)。在这里,我们描述了一种能够识别仅在细胞表面暴露的蛋白质在免疫中发挥作用的新方案,为该研究领域提供了一种更直接的方法来鉴定新的疫苗靶标。即使使用脑膜炎奈瑟氏球菌作为本文所述方案中的模型,该方案可用于任何革兰氏阴性细菌,提供修饰和优化以使其适应不同的细菌和疾病特征(例如薄膜脆性,生长方法,血清抗体水平,等等)。
背景 尝试开发针对N型的新型疫苗。脑膜炎脑膜炎常常依赖于2D SDS-PAGE(二维十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳)和蛋白质印迹,随后MS(质谱)(Wheeler等人,2007))。然而,这种方法采用全细胞裂解物,鉴定出不具有疫苗潜力的大量蛋白质(Mendum等人,2009)。因此,我们旨在开发一种能够鉴别可能在免疫中起重要作用的细胞表面暴露蛋白质的方法。简言之,我们的方案包括生长感兴趣的病原体,用免疫个体的血清免疫沉淀表面抗原,并通过液相色谱 - ...
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Affinity Purification of the RNA Degradation Complex, the Exosome, from HEK-293 Cells
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] The RNA exosome complex plays a central role in RNA processing and regulated turnover. Present both in cytoplasm and nucleus, the exosome functions through associations with ribonucleases and various adapter proteins (reviewed in [Kilchert et al., 2016]). The following protocol describes an approach to purify RNA exosome complexes from HEK-293 cells, making use of inducible ectopic expression, affinity capture, and rate-zonal centrifugation. The obtained RNA exosomes have been used successfully for proteomic, structural, and enzymatic studies (Domanski et al., 2016).
[摘要] RNA外植体复合物在RNA加工和调节营养中起核心作用。在细胞质和细胞核中存在,外来体通过与核糖核酸酶和各种衔接蛋白的关联起作用(参见[Kilchert等人,2016])。以下方案描述了从HEK-293细胞中纯化RNA外来体复合物的方法,利用可诱导的异位表达,亲和力捕获和速率 - 区带离心。所获得的RNA外来体已被成功地用于蛋白质组学,结构和酶学研究(Domanski等人,2016)。
在我们以前的工作中,我们建立了在四环素诱导型CMV启动子(HEK-293 Flp-In T-REx-Thermo Fisher)的控制下表达C末端3xFLAG标记的外来体组分EXOSC10(RRP6)的同基因HEK-293细胞系科学)。该系统允许我们以与内源WT蛋白质相当的水平表达标记的EXOSC10蛋白质,并且使用磁性抗FLAG亲和介质和来源于冷冻细胞粉末的蛋白质提取物来研究外来体纯化方案(Domanski等, / em>。,2012)。进一步探索使用的蛋白质提取条件,我们开发了一种允许在亲和捕获的外来体内保留DIS3(RRP44)的方案,否则证明是困难的(Hakhverdyan等人,2015)。基于这些研究,我们通过使用甘油密度梯度的速率区带离心法进一步纯化了RNA外来体(+/- DIS3)(Domanski等人,2016)。虽然蛋白质提取物中洗涤剂CHAPS(3 - ...
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Isolation of Exosomes from Semen for in vitro Uptake and HIV-1 Infection Assays
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Exosomes are membranous extracellular nanovesicles of endocytic origin. Exosomes are known to carry host and pathogen-derived genomic, proteomic, lipidomic cargos and other extraneous molecules. Exosomes are secreted by diverse cell types into the extracellular milieu and are subsequently internalized by recipient neighboring or distal cells. Upon internalization, exosomes condition recipient cells by donating their cargos and/or activating various signal transduction pathways, consequently regulating physiological and pathophysiological processes. Exosomes facilitate intercellular ...
[摘要] 外来体是内膜起源的膜性胞外纳米囊。 已知外来载体携带宿主和病原体衍生的基因组,蛋白质组,脂质体载体和其他外来分子。 外来体由不同细胞类型分泌到细胞外环境中,随后被受体相邻细胞或远端细胞内化。 在内化后,外来体通过捐赠其载体和或激活各种信号转导途径来调节受体细胞,从而调节生理和病理生理过程。 外来体促进细胞间通讯,调节细胞表型和调节微生物发病机制。 我们以前表明精液外来体(SE)抑制各种细胞类型的HIV-1复制。 在这里,我们描述特征SE的详细协议。 该方案可以适应或修改,并用于评估感兴趣的其他细胞外小泡。
外来体是由许多细胞类型的晚期内体室内的内体膜向内发生的结果而引起的膜状纳米囊(Simons and Raposo,2009)。外来体被许多细胞类型(Iglesias等人,2012)释放到细胞外环境中,并且被发现在包括血液在内的生物流体中(Kaur等人,2014)尿(Liem等人,2013)唾液(Madison等人,2015)和母乳(Madison等人,2014; Naslund ,2014)。人类精液含有由包括前列腺分泌腺泡细胞在内的男性生殖道组织产生的纳米囊泡的异质群体(Madison等人,2014; Madison等人,2015) (Sahlen等人,2002)和附睾上皮细胞(Frenette等人,2010)以及vasa感染,睾丸和囊泡腺细胞( ...
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