| Measurement of Energy-dependent Rhodamine 6G Efflux in Yeast Species
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Rhodamine 6G is a highly fluorescent dye often used to determine the transport activity of yeast membrane efflux pumps. The ATP-binding cassette transporter KlPdr5p confers resistance to several unrelated drugs in Kluyveromyces lactis. KlPdr5p also extrudes rhodamine 6G (R6G) from intact yeast cells in an energy-dependent manner. Incubation of yeast cells in the presence of 2-deoxy-D-glucose (inhibitor of glycolysis) and R6G (mitochondrial ATPase inhibitor) leads to marked depletion of intracellular ATP pool (Kolaczkowski et al., 1996). An active KlPdr5p ...
[摘要] 罗丹明6G是一种高荧光染料，常用于测定酵母膜外排泵的运输活性。 ATP结合盒转运蛋白Klr5p赋予乳酸克鲁维酵酵菌中几种不相关药物的抗性。 Pdr5p还以能量依赖的方式从完整的酵母细胞中挤出罗丹明6G（R6G）。 在2-脱氧-D-葡萄糖（糖酵解抑制剂）和R6G（线粒体ATP酶抑制剂）存在下酵母细胞的孵育导致细胞内ATP池的显着消耗（Kolaczkowski等人，1996）。 从完整的酵母细胞中可以直接测量R6G的荧光的直接测量PdF5p介导的来自完整酵母细胞的R6G的挤出。
【背景】多药物外排泵广泛分布，可在所有生物种类中找到。它们代表抗菌素耐药性的重要机制。量化外排泵活性的能力对于理解其对生理过程的贡献和评估潜在治疗药物（例如，外排抑制剂）的有效性（Blair和Piddock，2016）是必要的。外排活动测量的方法主要依赖于两种不同的机制。一些方法直接测量底物流出，即，多少基质被泵出，其他方法测量细胞内的底物分子积累，其水平然后用于间接推断流出。然而，后者由于可改变膜渗透性而改变了染料流入速率（Blair和Piddock，2016）的敏感性较差。 R6G在生长中的积累。白念珠菌细胞与ABC转运蛋白念珠菌药物抗性1（CDR1 ...
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| Quantification of the Mucilage Detachment from Arabidopsis Seeds
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Date:
2016-05-05
[Abstract] The Arabidopsis thaliana seed coat produces large amounts of cell wall polysaccharides, which swell out of the epidermal cells upon hydration of the mature dry seeds. While most mucilage polymers immediately diffuse in the surrounding solution, the remaining fraction tightly adheres to the seed, forming a dense gel-like capsule (Macquet et al., 2007). Recent evidence suggests that the adherence of mucilage is mediated by complex interactions between several cell wall components (Griffiths et al., 2014; Voiniciuc et al., 2015a). Therefore, it is important to ...
[摘要] 拟南芥种子产生大量的细胞壁多糖，其在成熟干种子水合时从表皮细胞中膨胀。 虽然大多数粘液聚合物立即在周围溶液中扩散，但剩余部分紧密粘附于种子，形成致密的凝胶状胶囊（Macquet等人，2007）。 最近的证据表明粘液的粘附由几个细胞壁组分之间的复杂相互作用介导（Griffiths等人，2014; Voiniciuc等人，2015a）。 因此，重要的是评估不同的细胞壁突变体如何影响这种粘液性质。 该协议有助于分析顺序提取的粘液部分中的单糖，并且量化每种成分从种子中的脱离。
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| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), Streptavidin and ATP-agarose Mediated Pull-down Analyses
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Date:
2013-09-20
[Abstract] Epstein-Barr virus (EBV) nuclear antigen 2 (EBNA2) induces expression of both viral and cellular genes in virus infected B cells by mimicking activated Notch receptors (Notch-IC) that mediate transcription activation through binding to the repressing domain of the recombining binding protein suppressor of hairless (RBP-Jκ). In general, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays, electrophoresis mobility shift assays (EMSA), streptavidin-agarose mediated DNA pull-down assays, together with cell-based transcription reporter assays were conducted to verify whether the query protein is involved ...
[摘要] EB病毒（EBV）核抗原2（EBNA2）通过模拟激活的Notch受体（Notch-IC）诱导病毒感染的B细胞中病毒和细胞基因的表达，所述Notch受体通过结合重组结合的抑制结构域介导转录激活无毛蛋白抑制剂（RBP-Jκ）。通常，进行染色质免疫沉淀（ChIP）测定，电泳迁移率变动测定（EMSA），链霉亲和素 - 琼脂糖介导的DNA下拉测定以及基于细胞的转录报道基因测定，以验证查询蛋白是否参与EBNA2依赖性转录。核伴侣核蛋白（NPM1）的ATP结合状态已涉及多效生物过程。开发ATP-琼脂糖介导的下拉方案以监测由ATP结合的NPM1诱导的引发前复合物的形成。根据EBNA2和Notch-IC已经显示出在B细胞系中靶基因的活化方面是部分可互换的，可以想象EBNA2是活化的Notch IC的生物学等价物。
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