| Quantitative Nucleocytoplasmic Transport Assays in Cellular Models of Neurodegeneration
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Nucleocytoplasmic transport deficits are suggested to play a role in neurodegenerative disorders, including amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Given the importance and complexity of this process, understanding when these aberrations occur and which pathways are involved is of great importance. Here, we make use of CRISPR-Cas9 technology to design cell lines stably expressing fluorophore proteins shuttling between the nucleus and cytoplasm by karyopherins of choice. To validate this protocol, we measured an ALS-associated nucleocytoplasmic transport pathway in the presence of the ...
[摘要] [摘要]核细胞质运输缺陷被认为在神经退行性疾病中发挥作用，包括肌萎缩性侧索硬化症（ALS）。鉴于这一过程的重要性和复杂性，了解这些畸变何时发生以及涉及哪些途径是非常重要的。在这里，我们利用CRISPR-Cas9技术来设计细胞系，稳定地表达荧光素蛋白在细胞核和细胞质之间穿梭的选择的卡里菲林。为了验证这个协议，我们测量了一个ALS相关的核细胞质运输途径，在疾病相关的多肽poly-PR的存在。这种技术允许测量在神经退行性疾病相关的背景下，在完整细胞中的一个特定的活性核细胞质运输途径。此外，这些实验可以在不需要昂贵的设备的情况下进行，并有可能升级为高通量筛选目的。
[背景]核细胞质运输对细胞稳态至关重要，并通过形成水通道的大型多蛋白复合物穿过核膜，称为核孔复合物（NPCs）（Stoffler et al., 1999; Ryan and Wente, 2000)。虽然这些通道允许小蛋白被动地平衡穿过核膜（被动运输），但大多数蛋白质似乎是由核素主动运输的，即进口蛋白或出口蛋白（主动运输）。含有核定位信号(NLS)的货物蛋白被导入素所定位。已经确定了各种受体介导的导入途径，但最有特色的途径涉及导入素-β1/导入素-α(KPNB1/KPNAx)，其中货蛋白含有经典的NLS(cNLS)，以SV40大T抗原NLS为例(Lange et al., ...
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| Phagocytosis Assay for α-Synuclein Fibril Uptake by Mouse Primary Microglia
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Microglia are professional phagocytes in the brain and deficiency in their phagocytic activity plays an important role in Parkinson’s disease. This protocol mainly describes the phagocytosis assay for uptake of α-synuclein preformed fibrils, a pathologic form of α-synuclein, by primary microglia.
[摘要] 小胶质细胞是大脑中的专业吞噬细胞，其吞噬活性的缺乏在帕金森病中起重要作用。 该方案主要描述了通过原代小胶质细胞摄取α-突触核蛋白预先形成的原纤维（α-突触核蛋白的病理形式）的吞噬作用测定。
【背景】作为大脑的免疫细胞，小胶质细胞在中枢神经系统中起着关键作用。在生理状态下，小胶质细胞不断探索周围环境并参与突触修剪。小胶质细胞可被任何类型的病理事件或脑内稳态的变化激活（Wolf et al。，2017）。激活后，小胶质细胞经历形态学变化，增殖，分泌炎性细胞因子，迁移至病变部位，吞噬病原体，病细胞，碎片，甚至细胞外蛋白质聚集体（Kettenmann et al。，2011; Fu et al。，2014）。 α-突触核蛋白是神经元中的丰富蛋白质，并且是帕金森病中称为路易体和路易神经突的神经元内包涵体的主要成分（Luk 等人，，2012）。最近的研究表明α-突触核蛋白经历细胞间扩散，小胶质细胞是α-突触核蛋白的主要清除剂，它可能承担来自神经元的α-突触核蛋白的负担（Wolf et al。，2017 ）。在这里，我们描述了使用人α-突触核蛋白单体产生预先形成的原纤维并通过小胶质细胞吞噬作用测量α-突触核蛋白预先形成的原纤维的摄取的方案（Du et al。，2017）。
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| Proximity Ligation Assay (PLA) Protocol Using Duolink® for T Cells
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Author:
Date:
2016-05-20
[Abstract] Protein-protein interaction experiments, such as co-immunoprecipitation (IP) assays, classically require tremendous amount of cells. This becomes a problem when your work focuses on rare cell populations (e.g., lymphocyte subtypes). O-link Bioscience has developed Proximity Ligation Assay (PLA) reagents and procedures to alleviate and solve this kind of issue. Moreover PLA experiments are read out using fluorescence or bright field microscopy, providing additional information on intracellular interactions localization significantly bettering classical IP procedures.
PLA ...
[摘要] 蛋白质 - 蛋白质相互作用实验，例如共免疫沉淀（IP）测定，经典地需要大量的细胞。当您的工作关注稀有细胞群体（例如淋巴细胞亚型）时，这成为一个问题。 O-link Bioscience开发了邻近连接测定（PLA）试剂和程序以缓解和解决这类问题。此外，使用荧光或明视场显微镜读出PLA实验，提供关于细胞内相互作用定位的额外信息，显着改善经典IP程序。 PLA试剂由互补的小寡核苷酸"负"和"正"探针组成，其特异性识别来自靶向您感兴趣的两种蛋白质的一抗（Abs）的宿主物种。实验必须使用来自不同物种，小鼠或山羊）作为PLA探针"减"或"加"对一抗的特定宿主物种（例如，"加"抗兔与"减"抗鼠或"加" "如果使用小鼠和兔初级Abs，则允许使用"减"抗兔组合的抗小鼠）。当两种PLA探针足够接近（40nm）时，在连接酶孵育后发生连接，产生环DNA。接下来，由于在该步骤中掺入的聚合酶和互补荧光核苷酸，这些形成环的DNA被扩增。每个发光点此后被认为是两种蛋白质之间的相互作用位点（图1）。
图1. Duolink ®实验的示意图。 ...
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