| Proximal Ligation Assay (PLA) on Lung Tissue and Cultured Macrophages to Demonstrate Protein-protein Interaction
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] In this protocol, we describe proximal ligation assay (PLA), an antibody-based detection method for protein-protein interaction. This method relies on specific binding of individual primary antibodies to the two putative interacting proteins. The primary antibodies need to have different hosts. The secondary antibodies against the two hosts have complementary oligonucleotide moieties attached to them. If the two antigens are in close proximity (presumably interacting with each other), the complementary oligonucleotides can anneal and fluorescent nucleotides can be incorporated in a single DNA ...
[摘要] 在这个协议中，我们描述近端连接测定（PLA），一种基于抗体的蛋白质相互作用检测方法。 这种方法依赖于个别一抗与两个推定的相互作用蛋白的特异性结合。 一抗需要有不同的宿主。 针对两种宿主的二抗具有与其连接的互补的寡核苷酸部分。 如果两种抗原紧密接近（推测彼此相互作用），则互补的寡核苷酸可以退火，并且荧光核苷酸可以并入单个DNA聚合步骤中。 在显微镜下，这些反应表现为点状荧光斑点，表明成功的PLA反应并提示两种抗原之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用。
【背景】近端连接测定法（PLA）是基于抗体的技术，以确定两种蛋白质是否彼此具有40nm。以这种方式检测到的蛋白质可以通过荧光来识别（Ho等人，2012; Banerjee等人，2015）。这使得PLA成为定位蛋白质 - 蛋白质相互作用的极好工具。 Toll样受体（TLR）途径的激活是致病性威胁的先天性免疫应答的重要组成部分。 TLR识别病原体相关分子并诱导信号级联以实现对感染的快速响应。 TLR2和TLR4是TLR家族的两个研究得非常好的成员，它们对不同的刺激有反应。尽管两种受体都响应细菌感染而激活，但只有TLR4响应脂多糖暴露。它们激活一些共享的信号级联，但包括MyD88 / Traf6通路。该途径的诱导包括形成被称为myddosome的信号复合物（Gay等人，2011; Xiong等人，2011; ...
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| Proximity Ligation Assay (PLA) Protocol Using Duolink® for T Cells
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Author:
Date:
2016-05-20
[Abstract] Protein-protein interaction experiments, such as co-immunoprecipitation (IP) assays, classically require tremendous amount of cells. This becomes a problem when your work focuses on rare cell populations (e.g., lymphocyte subtypes). O-link Bioscience has developed Proximity Ligation Assay (PLA) reagents and procedures to alleviate and solve this kind of issue. Moreover PLA experiments are read out using fluorescence or bright field microscopy, providing additional information on intracellular interactions localization significantly bettering classical IP procedures.
PLA ...
[摘要] 蛋白质 - 蛋白质相互作用实验，例如共免疫沉淀（IP）测定，经典地需要大量的细胞。当您的工作关注稀有细胞群体（例如淋巴细胞亚型）时，这成为一个问题。 O-link Bioscience开发了邻近连接测定（PLA）试剂和程序以缓解和解决这类问题。此外，使用荧光或明视场显微镜读出PLA实验，提供关于细胞内相互作用定位的额外信息，显着改善经典IP程序。 PLA试剂由互补的小寡核苷酸"负"和"正"探针组成，其特异性识别来自靶向您感兴趣的两种蛋白质的一抗（Abs）的宿主物种。实验必须使用来自不同物种，小鼠或山羊）作为PLA探针"减"或"加"对一抗的特定宿主物种（例如，"加"抗兔与"减"抗鼠或"加" "如果使用小鼠和兔初级Abs，则允许使用"减"抗兔组合的抗小鼠）。当两种PLA探针足够接近（40nm）时，在连接酶孵育后发生连接，产生环DNA。接下来，由于在该步骤中掺入的聚合酶和互补荧光核苷酸，这些形成环的DNA被扩增。每个发光点此后被认为是两种蛋白质之间的相互作用位点（图1）。
图1. Duolink ®实验的示意图。 ...
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