| Expression and Analysis of Flow-regulated Ion Channels in Xenopus Oocytes
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Mechanically-gated ion channels play key roles in mechanotransduction, a process that translates physical forces into biological signals. Epithelial and endothelial cells are exposed to laminar shear stress (LSS), a tangential force exerted by flowing fluids against the wall of vessels and epithelia. The protocol outlined herein has been used to examine the response of ion channels expressed in Xenopus oocytes to LSS (Hoger et al., 2002; Carattino et al., 2004; Shi et al., 2006). The Xenopus oocyte is a reliable system that allows for the ...
[摘要] 机械门控离子通道在机械传导中起关键作用，这是将物理力量转化为生物信号的过程。 上皮细胞和内皮细胞暴露于层流剪切应力（LSS），这是通过流体流向血管壁和上皮细胞壁所施加的切向力。 本文概述的方案已用于检查在非洲爪蟾卵母细胞中表达的离子通道对LSS的反应（Hoger等，2002; Carattino等，2004; Shi等，2006）。 非洲爪蟾卵母细胞是允许离子通道和调节蛋白的表达和化学修饰的可靠系统（George等，1989; Palmer等，1990; Sheng等，2001; Carattino等，2003）。 因此，该技术适用于研究允许流激活通道响应LSS的分子机制。
【背景】排列血管的泌尿道和内皮细胞的上皮细胞经受移动流体引起的机械力。这些力是层流剪切应力（LSS），与管状结构壁相切的摩擦力，以及垂直于流动方向的周向拉伸。令人信服的证据表明，LSS是响应肾和血管管状结构的流动变化而观察到的生理反应的主要决定因素（Satlin等，2001; Liu等，2003; Weinbaum等，2010） 。在这些设置中，离子通道具有将流体剪切应力传递到生物信号中的重要作用（Ranade等，2015）。例如，在肾的远端肾单位中，Na +再吸收和K ...
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| Secretion of Adipsin as an Assay to Measure Flux from the Endoplasmic Reticulum (ER)
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] In this protocol we describe a quantitative biochemical assay to assess the efficiency of endoplasmic reticulum (ER) to Golgi protein transport in adipocytes (Bruno et al., 2016). The assay takes advantage of the fact that adipocytes secrete various bioactive proteins, known as adipokines. As a measure of ER to Golgi flux we determine the rate of bulk secretion of the adipokine adipsin post washout of Brefeldin A (BFA) treatment using immunoblotting. Because BFA treatment results in an accumulation of adipsin in the ER, the exit of adipsin from the ER upon BFA washout is synchronized ...
[摘要] 在该方案中，我们描述了一种定量生化测定法来评估内质网（ER）对脂肪细胞中高尔基体蛋白质转运的效率（Bruno等，2016）。 该测定法利用脂肪细胞分泌各种生物活性蛋白质（称为脂肪因子）的事实。 作为对高尔基体通量的ER的测量，我们使用免疫印迹法确定了使用Brefeldin A（BFA）处理的脂肪因子adipsin后消失的体积分泌速率。 因为BFA治疗导致ER中Adipsin的积累，所以在BFA洗脱时，Adipsin从ER的出口在细胞和实验条件下同步。 因此，使用这种简单的测定法可以稳健地确定扰动，如敲低蛋白质，是否对高尔基蛋白转运的ER有影响。
【背景】新合成的蛋白质通过分泌途径从细胞分泌到细胞膜（PM）中。分泌路线包括从ER到高尔基体的运输，穿过高尔基体堆叠，以及从高尔基网络（TGN）到PM的运动。这些运输步骤中的每一个提供用于调节分泌物的节点。虽然大多数细胞能够分泌蛋白质，但某些特定的细胞类型是特异性蛋白质的专业秘密。脂肪细胞，例如，分泌激素，称为脂肪因子，影响各种器官的能量代谢。为了更好地了解脂肪因子分泌的分子基础，我们开发了一种测定方法，研究了从ER到脂肪细胞的高尔基体的脂肪因子，一种脂肪因子的转运。研究ER到高尔基体运输的传统和常用的方法是监测从ER融合到GFP（VSVG-GFP）的温度敏感性水泡性口炎病毒G蛋白ts045的出口（Presley等，1997）。使用adipsin分泌测定法研究脂肪细胞中的高铁运输的优点是监测来自ER的内源性蛋白质的通量，而不是异位表达的报道蛋白。 ...
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| Isolating Taste Buds and Taste Cells from Vallate Papillae of C57BL/6J Mice for Detecting Transmitter Secretion
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Author:
Date:
2016-06-05
[Abstract] Mouse is a well-accepted model for studying taste bud function. Mice readily detect and respond to taste substances that humans consider to have sweet, bitter, salty, sour and umami taste qualities. A great deal of recent research on taste receptors is based on this species. Live mice are needed for these experiments because no alternative in vitro model incorporates all elements of taste transduction and peripheral signaling. The C57BL/6J strain was selected because these mice respond robustly to many taste stimuli and because of variety of transgenic animals, such as PLCβ2-GFP and ...
[摘要] 鼠标是研究味蕾功能的一个被广泛接受的模式。小鼠容易检测和响应人们认为具有甜味，苦味，咸味，酸味和鲜味的品质的味道。最近对味觉感受器的大量研究是基于这个物种。这些实验需要活的小鼠，因为没有替代的体外模型包含所有的味觉转导和外周信号的元件。选择C57BL / 6J菌株，因为这些小鼠对许多味觉刺激反应强烈，并且由于来自该菌株的多种转基因动物，例如PLCβ2-GFP和GAD67-GFP。对C57BL / 6J小鼠进行的行为，神经反应，细胞电生理学和分子生物学的先前分析将为拟议研究奠定坚实的基础（Finger et al。，2005; Huang and Wu，2015; Huang et al。，2007 ）。因此，新鲜安乐死的动物必须用作味蕾的来源，我们将从中分离出味蕾和味道细胞。
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