| Ciberial Muscle 9 (CM9) Electrophysiological Recordings in Adult Drosophila melanogaster
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] The complexity surrounding presynaptic recordings in mammals is a significant barrier to the study of presynaptic mechanisms during neurotransmission in the mammalian central nervous system (CNS). Here we describe an adult fly neuromuscular junction (NMJ), the ciberial muscle 9 (CM9) NMJ, which allows for the recording of both evoked (EPSPs) and spontaneous postsynaptic excitatory potentials (mEPSPs) at a mature glutamatergic synapse. Combined with CM9-specific genetic technologies, the CM9 NMJ provides a powerful experimental system to better understand the regulation of neurotransmitter ...
[摘要] 围绕哺乳动物突触前记录的复杂性是哺乳动物中枢神经系统（CNS）神经传递过程中突触前机制研究的重要障碍。 在这里，我们描述成人飞行神经肌肉接头（NMJ），西伯利亚肌肉9（CM9）NMJ，其允许记录诱发（EPSP）和自发性突触后兴奋性潜力（mEPSPs）在成熟的谷氨酸能突触。 结合CM9特异性遗传技术，CM9 NMJ提供了一个强大的实验系统，以更好地了解成熟突触神经递质释放的调节。
【背景】在老化过程中定义突触前功能变化的重要障碍是由于缺乏一个简单的模型系统，用于执行必要的电生理记录，以彻底地表征神经递质从突触前神经末梢的释放。现有的啮齿动物模型遭受与衰老研究相关的显着成本问题和在具有一致释放参数的单个定义的神经末梢上使用电生理记录的技术难度。为了克服这些障碍，我们在成年果蝇中开创了一种模型突触系统，用于分析年龄对神经传递过程中突触前功能的影响，CM9 NMJ位于飞翔的长鼻（Rawson等） ，2012; Mahoney等人，2014; Mahoney等人，2016）（图4A）。简而言之，CM9运动神经元（MN）的突触前心轴收敛于CM9肌肉的15个肌肉纤维，以形成35个独立的神经支配（Rawson等人，2012）。已显示CM9 MN对于CM9肌肉的收缩是必需的，并且是CM9肌肉的谷氨酸能输入的唯一来源（Kimura等人，1986; ...
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| A Protocol for Production of Mutant Mice Using Chemically Synthesized crRNA/tracrRNA with Cas9 Nickase and FokI-dCas9
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Date:
2017-06-05
[Abstract] The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system is the most widely used genome editing tool. A common CRISPR/Cas9 system consists of two components: a single-guide RNA (sgRNA) and Cas9. Both components are required for the introduction of a double-strand break (DSB) at a specific target sequence. One drawback of this system is that the production of sgRNA in the laboratory is laborious since it requires cloning of an sgRNA sequence, in vitro transcription reaction and sgRNA purification. An alternative to targeting Cas9 ...
[摘要] 聚类规则间隔短回文重复（CRISPR）/ CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统是使用最广泛的基因组编辑工具。一个常见的CRISPR / Cas9系统由两个组成部分组成：单导RNA（sgRNA）和Cas9。在特定靶序列引入双链断裂（DSB）需要两种成分。该系统的一个缺点是实验室中sgRNA的生产是费力的，因为它需要在体外转录反应和sgRNA纯化之间克隆sgRNA序列。通过sgRNA靶向Cas9活性的替代方案是用两种小RNA：CRISPR RNA（crRNA）和反式激活性crRNA（tracrRNA）进行靶向。这两种小RNA可以化学合成，这使得与sgRNA相比，这些RNA的产生不那么困难。 CRISPR / Cas9系统的另一个缺点是已经报告了脱靶效应。然而，已经开发了改进形式的Cas9以最小化离靶效应。例如，仅当两个引导RNA在规定的距离内结合相对的链时，切口酶型Cas9（nCas9）和FokI结构域融合的催化无活性的Cas9（FokI-dCas9; fCas9）才诱导DSB。在本协议中，我们描述了使用结合crRNA，tracrRNA和Cas9修饰形式的CRISPR / Cas9系统来生产突变小鼠的实验系统。该方法不仅有利于制备用于基因组编辑系统的试剂，而且可以降低脱靶效应的风险。
背景 ...
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| Transplantation of Mesenchymal Cells Including the Blastema in Regenerating Zebrafish Fin
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Author:
Date:
2017-01-20
[Abstract] Regeneration of fish fins and urodele limbs occurs via formation of the blastema, which is a mass of mesenchymal cells formed at the amputated site and is essential for regeneration. The blastema transplantation, a novel technique developed in our previous studies (Shibata et al., 2016; Yoshinari et al., 2012) is a useful approach for tracking and manipulating the blastema cells during fish fin regeneration.
[摘要] 鱼鳍和尿le肢的再生通过形成大气泡，其是在截肢位点处形成的质量的间充质细胞并且对于再生是必需的。胚胎移植是我们以前研究（Shibata等人，2016; Yoshinari等人，2012）开发的一种新技术，是一种有用的方法，用于跟踪和操纵鱼翅再生期间的blastema细胞。
背景在诸如鱼，两栖动物和哺乳动物之类的动物模型的早期胚胎阶段常规进行细胞移植研究，但将移植细胞靶向特定组织是困难的。在我们的研究中开发的Blastema移植是将间充质供体细胞引入宿主翅片射线的有效方法。它使我们能够在鱼翅再生期间跟踪细胞命运和/或操纵细胞信号，如成纤维细胞生长因子（Fgf）。实际上，在我们最近出版的作品中，我们将携带hsp701：显性负性fgf受体和β-肌动蛋白：dsRed2转基因的blastema细胞移植到野生型类型blastema区域并且在鳍状线间充质细胞的子集（Shibata等人，2016）中马齿抑制Fgf信号传导。该方法适用于分析其他细胞信号和通过活细胞成像跟踪细胞命运。
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