Lentiviral shRNA Screen to Identify Epithelial Integrity Regulating Genes in MCF10A 3D Culture
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] MCF10A 3D culture system provides a reductionist model of glandular mammary epithelium which is widely used to study development of glandular architecture, the role of cell polarity and epithelial integrity in control of epithelial cell functions, and mechanisms of breast cancer. Here we describe how to use shRNA screening approach to identify critical cell pathways that couple epithelial structure to individual cell based responses such as cell cycle exit and apoptosis. These studies will help to interrogate genetic changes critical for early breast tumorigenesis. The protocol describes a ...
[摘要] MCF10A 3D文化系统提供了腺体乳腺上皮的还原剂模型,其广泛用于研究腺体结构的发育,细胞极性和上皮完整性在上皮细胞功能的控制中的作用以及乳腺癌的机制。在这里我们描述如何使用shRNA筛选方法来识别关键细胞通路,夫妇上皮结构到个别细胞的反应,如细胞周期退出和凋亡。这些研究将有助于询问对早期乳腺肿瘤发生至关重要的遗传变化。该协议描述了设计用于靶向上皮完整性的慢病毒shRNA构建体的文库和用于悬浮MCF10A培养物的慢病毒转导的高效方法。此外,提供的协议设置MCF10A 3D文化在Matrigel的形态和细胞反应研究通过结构化照明和共聚焦显微镜分析免疫染色的三维结构。 关键字: 3D文化,MCF10A,shRNA,上皮完整性,免疫荧光染色,3D成像,形态测量分析 [背景] 上皮细胞形成高度组织的组织结构,其提供物理支持和用于协调细胞信号传导的结构化支架。跨上皮结构的这种协调的信号传导对于上皮生物学是基本的;使得上皮细胞在调节器官大小,形状,功能和基于个体细胞的应答中的动态联合作用(Roignot等人,2013; Shamir和Ewald,2014)。上皮信号传导的联合指挥还提供了一种强有力的肿瘤抑制机制,通过将外部和内部有丝分裂信号门控到静止的上皮组织(Partanen等人,2013; Rejon等人 ...
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Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Direct Visualization of Protein-Protein Interaction in vivo
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Author:
Date:
2013-10-20
[Abstract] Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) assay is a method used to directly visualize protein-protein interaction in vivo using live-cell imaging or fixed cells. This protocol described here is based on our recent paper describing the functional association of human chromatin adaptor and transcription cofactor Brd4 with p53 tumor suppressor protein (Wu et al., 2013). BiFC was first described by Hu et al. (2002) using two non-fluorescent protein fragments of enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), which is an Aequorea victoria GFP variant protein, ...
[摘要] 双分子荧光互补(BiFC)测定是用于使用活细胞成像或固定细胞直接观察蛋白质 - 蛋白质相互作用的方法。这里描述的协议是基于我们最近的论文描述人类染色质衔接子和转录辅因子Brd4与p53肿瘤抑制蛋白的功能联系(吴等人。2013年)。 BiFC首先由Hu等人(2002)使用增强的黄色荧光蛋白(EYFP)的两种非荧光蛋白片段描述,所述荧光蛋白是Aequorea victoria GFP变体蛋白,分别融合Rel家族蛋白和bZIP家族转录因子,以调查这两个家庭成员在活细胞之间的相互作用。通过引入突变以降低其对pH和氯离子的敏感性,从而产生称为金星荧光蛋白的超增强YFP,而在37℃下不显示减少的荧光,如通常用EYFP观察到的,YFP被改进(Nagai等al。,2006)。荧光信号通过两个非荧光片段(例如,金黄N末端1-158个氨基酸残基,称为Venus-N)及其C-末端159-239个氨基酸的互补而再生残基,命名为Venus-C;参见图1A和Gully等人,2012; Ding等人,2006; ...
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Immunofluorescence Staining on Mouse Embryonic Brain Sections
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Author:
Date:
2012-06-05
[Abstract] This protocol comprises the entire process of immunofluorescence staining on mouse embryonic brains, starting from tissue preparation to mounting of the tissue sections.
[摘要] 本协议旨在介绍通过经心灌注和提取大脑牺牲大鼠的方法,并介绍用c-Fos和Arc抗体染色大鼠脑组织的方法。 请注意,蛋白质的表达对触发神经活动的行为范例非常敏感。...
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