| Assaying the Effects of Splice Site Variants by Exon Trapping in a Mammalian Cell Line
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] There are several in silico programs that endeavor to predict the functional impact of an individual’s sequence variation at splice donor/acceptor sites, but experimental confirmation is problematic without a source of RNA from the individual that carries the variant. With the aid of an exon trapping vector, such as pSPL3, an investigator can test whether a splice site sequence change leads to altered RNA splicing, through expression of reference and variant mini-genes in mammalian cells and analysis of the resultant RNA products.
[摘要] 有几个计算机程序尝试预测个体在剪接供体/受体位点的序列变异的功能影响，但实验确认是有问题的，没有携带变体的个体的RNA来源。借助于外显子捕获载体，例如pSPL3，研究人员可以通过在哺乳动物细胞中表达参考和变体小基因来测试剪接位点序列变化是否导致改变的RNA剪接，并分析所得RNA产物。
背景 我们希望通过实验测试在TEK基因中鉴定的两个剪接供体位点变体c.760 + 2T> C和c.3300 + 2delT的功能影响（Souma等人，2016）。通常情况下，携带这些序列变体的个体不能获得细胞或mRNA的样品，因此我们利用外显子捕获方法作为功能测试。来自患者的DNA样品可用于感兴趣的基因组区域的PCR扩增。如果患者gDNA样品不可用，也可以通过诸如基于PCR的定点诱变等方法将序列变体并入野生型序列。
＆NBSP;外显子捕获方法最初是为了鉴定长期基因组DNA中的未知外显子而开发的（Duyk等人，1990）。创建了pSPL3外显子捕获载体以提高外显子鉴定的效率和可靠性，并且还允许筛选更大的基因组片段（Church et al。，1994; Nisson等，1994）。 pSPL3载体含有由SV40启动子组成的小型人造基因，具有功能性剪接供体和受体位点的外显子 - 内含子 - ...
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| Reversible Cryo-arrests of Living Cells to Pause Molecular Movements for High-resolution Imaging
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Fluorescence live-cell imaging by single molecule localization microscopy (SMLM) or fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) in principle allows for the spatio-temporal observation of molecular patterns in individual, living cells. However, the dynamics of molecules within cells hamper their precise observation. We present here a detailed protocol for consecutive cycles of reversible cryo-arrest of living cells on a microscope that allows for a precise determination of the evolution of molecular patterns within individual living cells. The usefulness of this approach has been ...
[摘要] 通过单分子定位显微镜（SMLM）或荧光寿命成像显微镜（FLIM）的荧光活细胞成像原理上允许在个体，活细胞中的分子模式的时空观察。然而，细胞内分子的动力学阻碍了它们的精确观察。我们在这里介绍一个详细的方案，用于显微镜上活细胞可逆冷冻停滞的连续循环，允许精确测定各个活细胞内分子模式的演变。通过观察受体酪氨酸激酶的配体诱导的聚集以及SMLM和FLIM的活性模式已经证明了该方法的有用性（Masip等人，2016）。
了解细胞中的分子过程，例如受体 - 酪氨酸激酶（RTK）的配体诱导反应需要精确的时空观察分子模式。由于细胞状态的差异，这种反应需要在个体细胞而不是细胞群体中进行监测（Snijder和Pelkmans，2011）。使用SMLM，各个分子可以以高精度进行定位（Betzig等人，2006）。这允许例如提取关于质膜中的RTK聚类的信息。互补地，共焦FLIM可以揭示分子如何在衍射受限体积元素内作为整体反应。这可以通过使用构象传感器揭示RTK与下游分子的相互作用模式，磷酸化模式以及活性模式（Offterdinger等人，2004; Sabet等人）。 ...
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| Cell Surface Protein-protein Binding on COS-7 Cells
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Author:
Date:
2014-01-05
[Abstract] Examination of interactions between a transmembrane protein and a soluble protein by pull-down or immunoprecipitation assays can be tricky and complicated due to the detergent extraction of membrane proteins during the lysate preparation step. The choice and concentration of detergents must be determined empirically and the procedure can be burdensome. Here, we describe a simplified binding assay by expressing the membrane protein of interest in COS-7 cells and applying detergent-free solutions containing an extracellular protein to be tested. The binding is then examined by ...
[摘要] 通过下拉或免疫沉淀测定法检查跨膜蛋白和可溶性蛋白质之间的相互作用可能是棘手和复杂的，因为在裂解物制备步骤期间膜蛋白的去污剂提取。 洗涤剂的选择和浓度必须根据经验确定，并且该方法可能是繁重的。 在这里，我们描述简化的绑定测定通过表达感兴趣的COS蛋白的COS 7细胞和应用含有待测试的细胞外蛋白的无洗涤剂溶液。 然后通过免疫细胞化学检查结合。
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