| Ex vivo Ooplasmic Extract from Developing Drosophila Oocytes for Quantitative TIRF Microscopy Analysis
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] Understanding the dynamic behavior and the continuously changing composition of macromolecular complexes, subcellular structures and organelles is one of areas of active research in both cell and developmental biology, as these changes directly relate to function and subsequently to the development and homeostasis of the organism. Here, we demonstrate the use of the developing Drosophila oocyte to study dynamics of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) with high spatiotemporal resolution. The combination of Drosophila genetics with total internal reflection (TIRF) ...
[摘要] 了解大分子复合物，亚细胞结构和细胞器的动态行为和不断变化的组成是细胞和发育生物学中积极研究的领域之一，因为这些变化与功能和随后的生物体的发育和稳态直接相关。 在这里，我们演示了使用发展中的果蝇卵母细胞来研究具有高时空分辨率的信使核糖核蛋白复合物（mRNPs）的动力学。 果蝇的遗传学与全内反射（TIRF）显微镜，图像处理和数据分析结合，以前所未有的精确度了解了mRNP的运动性和组成动力学。
【背景】细胞内运输是活细胞的基本过程之一。几乎细胞内的所有细胞 - 离子，分子，复合物，细胞器 - 被积极地传输，使局部熵减少。尽管近年来，我们对这些运输过程的机理有了很大的了解，但我们的大部分知识来自于体外和细胞培养研究。在这些简化的系统中，很难确定是否利用运输监管流程的全部潜力。另一方面，组织，器官，组织和生物体通常太复杂，无法有效地研究时空分辨率，足以匹配这些运输过程的规模。为了结合自下而上和自上而下的方法的优点，已经开发了在保持复杂性的同时，使这些过程更易于访问的技术。一个例子是从ambiphian（例如，非洲爪蟾）卵母细胞和胚胎中制备大量细胞质提取物来研究细胞分裂（Lohka和Masui，1983; Murray，1991; Sawin和Mitchison，1991）。我们最近显示，在细胞质液滴 - ...
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| Dot Blot Analysis of N6-methyladenosine RNA Modification Levels
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Author:
Date:
2017-01-05
[Abstract] N6-methyladenosine (m6A) is the most prevalent internal modification of eukaryotic messenger RNA (mRNA). The total amount of m6A can be detected by several methods, such as dot blot analysis using specific m6A antibodies and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) (Fu et al., 2014; Shen et al., 2016). Here we describe the method for fast detection of total m6A levels in mRNA by dot blot analysis using a specific m6A antibody.
[摘要] N 6 - 甲基腺苷（m 6）是真核信使RNA（mRNA）的最普遍的内部修饰。可以通过几种方法检测m 6的总量，例如使用特异性m 5抗体的斑点印迹分析和定量液相色谱 - 串联质谱（LC- MS / MS）（Fu等人，2014; Shen等人，2016）。在这里，我们描述使用特异性m 5抗体通过斑点印迹分析来快速检测mRNA中的总m 6 A水平的方法。
背景 与其他方法（如二维薄层色谱和LC-MS / MS）相比，mRNA检测的斑点印迹分析相对容易，快速，经济有效。这种方法可以以定性的方式用于评估在不同发育阶段的各种植物组织或植物中的m A水平的时间和空间变化。这对于通过其他复杂和定量方法进行详细调查之前初步检查相关突变体中m A水平的变化特别有用。
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| Cell Surface Protein Biotinylation and Analysis
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Author:
Date:
2013-08-20
[Abstract] A great way to specifically isolate and quantify proteins in the cell surface membrane is to take advantage of the biotinylation technique. It consists of labeling cell surface proteins with a biotin reagent before lysing the cells, and isolating these tagged proteins by NeutrAvidin pull-down. Then, the samples are subjected to SDS-PAGE separation, transferred to PVDF membranes and probed with specific antibodies. Quantification of cell surface expression is accomplished by densitometric measurement of the bands corresponding to the protein of interest and subsequent normalization by a ...
[摘要] 特异性分离和定量细胞表面膜中的蛋白质的好方法是利用生物素化技术。 它包括在裂解细胞之前用生物素试剂标记细胞表面蛋白，并通过NeutrAvidin下拉分离这些标记的蛋白。 然后，将样品进行SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜并用特异性抗体探测。 细胞表面表达的定量通过密度测量对应于感兴趣的蛋白质的条带并随后通过膜蛋白质（作为对照）标准化来完成。
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