| Quantification of Protein Kinase A (PKA) Activity by An in vitro Radioactive Assay Using the Mouse Sperm Derived Enzyme
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] In order to acquire fertilizing potential, mammalian sperm must undergo a process known as capacitation, which relies on the early activation of Protein Kinase A (PKA). Frequently, PKA activity is assessed in whole-cell experiments by analyzing the phosphorylation status of its substrates in a western-blot. This technique faces two main disadvantages: it is not a direct measure of the kinase activity and it is a time-consuming approach. However, since PKA can be readily obtained from sperm extracts, in vitro assays such as the “radioactive assay” can be ...
[摘要] [Abstract]为了获得受精潜能，哺乳动物的精子必须经历一个被称为电容的过程，这个过程依赖于蛋白激酶A（PKA）的早期激活。通常，在全细胞实验中，通过分析其底物在western-blot中的磷酸化状态来评估PKA的活性。这种技术面临着两个主要的缺点：它不是对激酶活性的直接测量，而且是一种耗时的方法。然而，由于PKA可以很容易地从精子提取物中获得，体外检测如"放射性检测"可以使用原生酶进行。与western-blot不同的是，放射性测定法是一种直接的技术，通过将整合的32P定量到肽类底物中来评价PKA的活性。这种方法很容易允许分析PKA的不同激动剂或拮抗剂。由于小鼠精子是可溶性PKA的丰富来源，这种测定法可以进行简单的分馏，使PKA既可用于体外测试药物对PKA活性的影响，也可用于跟踪PKA活性在增容开始时的变化。
[Background] ...
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| An in vitro Assay to Screen for Substrates of PKA Using Phospho-motif-specific Antibodies
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Author:
Date:
2020-04-20
[Abstract] Kinases function as regulators of many cellular processes such as cell migration. These enzymes typically phosphorylate target motif sequences. Mass spec or phospho-specific antibody detection can be used to determine whether a kinase can phosphorylate proteins of interest, however, mass spec can be expensive and phospho-antibodies for the protein of interest may not exist. In this protocol, we will describe an in vitro kinase assay to provide a preliminary readout on whether a protein of interest may be phosphorylated by PKA. Our protein of interest is purified after expression in ...
[摘要] [摘要 ] 激酶可充当许多细胞过程（例如细胞迁移）的调节剂，这些酶通常可磷酸化靶基序序列，质谱或磷酸特异性抗体检测可用于确定激酶是否可磷酸化目标蛋白。能成为规格昂贵和磷酸化抗体蛋白的兴趣可能就不存在。在这个协议中，我们将介绍一种在体外 激酶测定法可提供有关目的蛋白是否可被PKA磷酸化的初步读数。我们的目的蛋白在细菌中表达后纯化，并用牛心脏的重组PKA处理，然后提取蛋白，并使用蛋白印迹进行蛋白质印迹磷酸化针对PKA靶标的特异性抗体，这将使我们能够快速确定PKA是否可能使我们感兴趣的蛋白质磷酸化。
[背景 ] 激素和其他因素会通过G连接的G蛋白偶联受体（GPCR）激活腺苷酸环化酶并随后促进第二信使cAMP的产生，从而影响细胞迁移等细胞过程。cAMP水平升高会导致PKA激活，丝氨酸-苏氨酸激酶在迁移细胞中肌动蛋白细胞骨架动力学的调节中起着重要作用.PKA影响肌动蛋白细胞骨架调节过程的不同方面，包括a）Rho-fa 微小GTPases （Rho，Rac 和Cdc42）的调节活性， B）肌动蛋白结合蛋白（例如，VASP [血管舒张兴奋剂的UI Ated磷蛋白]），C）激酶间接地控制肌动蛋白结合蛋白（的作用例如，P21活化激酶）和d）肌球蛋白（豪，2004） 。但是，PKA和其他激酶也可以通过磷酸化调节其他蛋白质，目前尚不知道。
有M 的UI ...
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| High-throughput YO-PRO-1 Uptake Assay for P2X7 Receptors Expressed in HEK Cells
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] P2X7 receptors are extracellular ATP-gated ion channels that play broad physiological and pathological roles in animals (Sluyter, 2017). Activation of P2X7 receptors lead to the opening of membrane channels permeable for small cations like Na+ and Ca2+ as well as fluorescent dyes such as YO-PRO-1 (Alves et al., 2014). Taking advantage of this dye-permeability, YO-PRO-1 uptake assays have been widely used to probe P2X7 receptor activity (Surprenant et al., 1996; Rassendren et al., 1997; Karasawa et al., 2017). Here we describe a step by ...
[摘要] P2X7受体是细胞外ATP门控离子通道，在动物中发挥广泛的生理和病理作用（Sluyter，2017）。 P2X7受体的激活导致膜通道的开放可渗透小阳离子如Na + 和Ca 2 + 以及荧光染料如YO-PRO-1（Alves） et al。，2014）。 利用这种染料渗透性，YO-PRO-1摄取试验已被广泛用于探测P2X7受体活性（Surprenant et al。，1996; Rassendren et al。 ，1997; Karasawa et al。，2017）。 在这里，我们描述了使用表达P2X7受体的HEK293细胞进行高通量YO-PRO-1摄取测定的逐步方案。 这个为期3天的方案特别适用于检查小分子和突变对P2X7受体功能的影响。 该协议改编自我们之前发表的论文（Karasawa和Kawate，2016）。
【背景】P2X7受体打开可渗透阳离子的膜通道（Surprenant et al。，1996; Sluyter，2017）。虽然电生理学仍然是量化P2X7受体活性的金标准，但这种专门技术可能并不容易获得。此外，电生理学不适合高通量筛选，因为每次记录需要大量的时间和操作。因此，荧光分子的摄取是一种广泛使用的替代方法，特别是用于筛选多种条件/突变体（Cankurtaran-Sayar et al。，2009; Qu et al。 ...
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