| Thermal Stability of Heterotrimeric pMHC Proteins as Determined by Circular Dichroism Spectroscopy
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] T cell receptor (TCR) recognition of foreign peptide fragments, presented by peptide major histocompatibility complex (pMHC), governs T-cell mediated protection against pathogens and cancer. Many factors govern T-cell sensitivity, including the affinity of the TCR-pMHC interaction and the stability of pMHC on the surface of antigen presenting cells. These factors are particularly relevant for the peptide vaccination field, in which more stable pMHC interactions could enable more effective protection against disease. Here, we discuss a method for the determination of pMHC stability that we ...
[摘要] 由肽主要组织相容性复合物（pMHC）提供的外源肽片段的T细胞受体（TCR）识别控制T细胞介导的针对病原体和癌症的保护。 许多因素控制T细胞敏感性，包括TCR-pMHC相互作用的亲和力和pMHC在抗原呈递细胞表面的稳定性。 这些因素对于肽疫苗接种领域尤其重要，其中更稳定的pMHC相互作用可以实现更有效的防止疾病的保护。 在这里，我们讨论一种测定pMHC稳定性的方法，我们已经用来调查HIV免疫逃逸，T细胞对癌症抗原的敏感性和导致自身免疫的机制。
【背景】CD8 + T细胞对外来入侵者或失调自身的反应的能力取决于细胞表面上稳定的pMHC I类（pMHCI）表达。在结构上，MHCI分子在α1和α2结构域之间的界面处形成由两个平行的α螺旋形成的肽结合槽，其具有β片的底部（Latron等人，1992）。肽结合槽具有与结合肽的N-和C-末端紧密相互作用的特异性氨基酸的主要肽结合口袋（B和F）。虽然这些口袋可以适应一系列氨基酸，但它们表现出对使用结构和生物化学方法表征的某些侧链的偏好（Parker等人，1992）。该信息已被用于产生所谓的“异型”肽，其中具有差的MHC锚的天然肽可以用与MHC最佳结合的氨基酸进行修饰（Cole等人，2010 ...
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| Quantification of Triphenyl-2H-tetrazoliumchloride Reduction Activity in Bacterial Cells
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Author:
Date:
2017-01-20
[Abstract] This protocol describes the use of the 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) salt to evaluate the cell redox potential of rhizobia cells. The production of brightly colored and insoluble 1,3,5-Triphenyltetrazolium formazan arising from TTC reduction is irreversible and can be easily quantified using a spectrophotometer. This protocol allows the production of reproducible results in a relatively short time for Sinorhizobium meliloti 1021 cells grown both in exponential and stationary phases. The results here presented show that the S. meliloti cells deriving from ...
[摘要] 该方案描述了使用2,3,5-三苯基-2H-四唑氯化物（TTC）盐来评估根瘤细胞的细胞氧化还原电位。由TTC还原产生的鲜色不溶性1,3,5-三苯基四唑甲The的生产是不可逆的，可以使用分光光度计轻松地定量。该方案允许在相对较短的时间内在指数阶段和固定阶段生长的中华根瘤菌中华根瘤菌1021细胞产生可重复的结果。这里提出的结果表明，与来自固定相培养物的细胞相比，从指数阶段培养物得到的猕猴桃细胞具有增加的细胞氧化还原电位。这意味着在指数增长条件下， meliloti 细胞产生更大量的TTC减少所需的还原等同物。
背景 TTC盐是一种水溶性和无色的化合物，可以还原成甲an，高度着色的化合物。甲醛的不可逆形成可以使用分光光度计进行定量。由于其性质和其降低的潜力，该四唑盐广泛用于真核生物和原核生物两者，作为细胞氧化还原活性，活力，药物敏感性和底物利用测定的指标（Byth等人， 2001; Hayashi等人，2003; Raut等人，2008; Lin等人，2008）。由于膜电位，四唑鎓盐的净正电荷有助于细胞摄取，从而允许其细胞内还原（Berridge等人，2005）。在原核生物中，TTC降低的主要研究涉及革兰氏阴性呼吸细菌大肠杆菌，而对Rhizobiacea 家族的成员只有少数研究报道。在这个协议中，这个家族最好的遗传特征成员之一， ...
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| Monoclonal Antibody Purification (Nicotiana benthamiana Plants)
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Author:
Date:
2014-01-20
[Abstract] Plant-based expression systems provide an alternative biomanufacturing platform for recombinant proteins (Matoba et al., 2011). In particular, plant virus-based vectors can overexpress proteins within days in the leaf tissue of Nicotiana benthamiana (N. benthamiana). To overcome the issues of genetic instability and limited infectivity of recombinant viruses, Agrobacterium-mediated delivery of “deconstructed” virus vectors has become the mainstay for the production of large and/or multicomponent proteins, such as immunoglobulin (Ig)G monoclonal antibodies ...
[摘要] 基于植物的表达系统为重组蛋白提供了替代的生物制造平台（Matoba等人，2011）。特别地，基于植物病毒的载体可以在烟草（Nicotiana benthamiana）（本塞姆氏烟草）的叶组织中天数内过表达蛋白质。为了克服重组病毒的遗传不稳定性和有限的感染性的问题，土壤杆菌介导的"解构的"病毒载体的递送已经成为生产大和/或多组分蛋白如免疫球蛋白的主要方法Ig）G单克隆抗体（mAb）。在这里，我们描述了在N中产生人IgG mAbs的方法。本生烟草使用烟草花叶病毒复制子载体magnICON 。载体在7天内可以表达高达几百mg的mAb/kg叶材料。显示了分别用于广泛中和的抗HIV和抗流感mAbs VRC01和CR6261的代表性病例（Hamorsky等人，2013）。叶组织匀浆，通过过滤和离心澄清提取物。 mAb通过快速蛋白质液相色谱（FPLC）使用蛋白A亲和力和Phenyl HP疏水界面树脂纯化。
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