| Reconstitution of Chromatin by Stepwise Salt Dialysis
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] Chromatin, rather than plain DNA, is the natural substrate of the molecular machines that mediate DNA-directed processes in the nucleus. Chromatin can be reconstituted in vitro by using different methodologies. The salt dialysis method yields chromatin that consists of purified histones and DNA. This biochemically pure chromatin is well-suited for a wide range of applications. Here, we describe simple and straightforward protocols for the reconstitution of chromatin by stepwise salt dialysis and the analysis of the chromatin by the micrococcal nuclease (MNase) digestion assay. Chromatin that ...
[摘要] [摘要]染色质而不是普通的DNA是介导细胞核中DNA定向过程的分子机器的天然底物。染色质可以重新构建d体外b ÿ使用不同的方法。盐渗析法产生的染色质由纯化的组蛋白和DNA组成。这种生物化学纯的染色质非常适合广泛的应用。在这里，我们描述了通过逐步盐透析和通过微球菌核酸酶（MNase）消化测定法对染色质进行分析的染色质重构的简单明了的协议。该复原用该方法染色质，可用于高效同源定向修复（HDR）介导的基因编辑编 使用CRISPR-Cas9系统，以及用于染色质动力学和功能的生化研究。
[背景]真核细胞中的DNA被组织成染色质。因此，理想情况下，DNA定向过程的分析（例如复制，重组，修复和转录）将使用染色质模板而不是纯DNA进行（Kadonaga，2019）。为此，染色质可通过使用ATP依赖性或ATP依赖性方法在体外从纯化的成分中重建（有关综述，请参见Lusser和Kadonaga，2004年）。
在这里，我们描述了染色质重建的特定方法，该方法在我们利用CRISPR-Cas9系统对细胞进行HDR介导的基因编辑研究中采用了（Cruz-Becerra和Kadonaga，2020年）。在这项工作中，我们发现相对于普通的（裸）DNA供体模板，通过使用染色质供体模板可以增强精确的HDR介导的DNA插入。我们还将这种方法用于染色质的生化分析，包括高迁移性N组（HMGN）蛋白（Rattner等，2009），染色质动力学（Torigoe等，2013），前核小体（Fei）的表征。等人，2015年），以及核小体失稳因子（NDF）（F ...
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| Analysis of RNA-protein Interactions Using Electrophoretic Mobility Shift Assay (Gel Shift Assay)
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Author:
Date:
2013-11-20
[Abstract] RNA binding proteins (RBPs) play a crucial role in regulating gene expression at the post-transcriptional level at multiple steps including pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA stability, mRNA localization and translation. RBPs regulate these processes primarily by binding to specific sequence elements in nascent or mature transcripts. There are several hundreds of RBPs in plants, but the targets of most of them are unknown. A variety of experimental methods have been developed to identify targets of an RBP. These include RNA immunoprecipitation (RIP), UV cross-linking and ...
[摘要] RNA结合蛋白（RBP）在包括前mRNA剪接，多聚腺苷酸化，mRNA稳定性，mRNA定位和翻译的多个步骤在调节转录后水平的基因表达中起关键作用。 RBP主要通过结合新生或成熟转录物中的特定序列元件来调节这些过程。植物中有几百个RBP，但其中大多数的目标是未知的。已经开发了各种实验方法来鉴定RBP的目标。这些包括RNA免疫沉淀（RIP），UV交联和免疫沉淀（CLIP）和CLIP的许多变体（例如PAR-CLIP，iCLIP）。这些方法取决于使用针对该RBP的抗体与特异性RBP结合的RNA的免疫沉淀。电泳迁移率变动分析（EMSA），也称为凝胶移位分析，已被用于分析蛋白质 - 核酸相互作用。它是一种简单而强大的方法来分析蛋白质-RNA/DNA相互作用。在RNA EMSA中，通过在蛋白质存在下比较RNA的迁移来可视化RNA-蛋白质复合物。通常，在RNA EMSA中，使用特异性RNA序列来分析其与蛋白质的相互作用。将具有荧光标记的体外转录的32 P标记的或化学合成的RNA与或不与目标蛋白一起温育，然后将反应混合物在天然聚丙烯酰胺凝胶电泳上运行。 RNA-蛋白复合物与游离RNA相比缓慢迁移，其可以使用成像系统可视化。除了测试RBP与RNA的结合之外，EMSA还用于绘制参与相互作用的RNA和/或蛋白质中的区域。此外，还可以使用EMSA定量结合亲和力。
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