| High-throughput Microscopic Analysis of Salmonella Invasion of Host Cells
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Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract] Salmonella is a Gram-negative bacterium causing a gastro-enteric disease called salmonellosis. During the first phase of infection, Salmonella uses its flagella to swim near the surface of the epithelial cells and to target specific site of infection. In order to study the selection criteria that determine which host cells are targeted by the pathogen, and to analyze the relation between infecting Salmonella (i.e., cooperation or competition), we have established a high-throughput microscopic assay of HeLa cells sequentially infected with fluorescent ...
[摘要] 沙门氏菌是革兰氏阴性细菌，引起称为沙门氏菌病的胃肠疾病。在感染的第一阶段，沙门氏菌使用其鞭毛在上皮细胞表面附近游泳并靶向特定的感染部位。为了研究确定哪种宿主细胞被病原体靶向的选择标准，并分析感染沙门氏菌（ ie ，合作或竞争）之间的关系，我们有建立了对荧光细菌依次感染的HeLa细胞的高通量显微镜检测。使用自动化图像分析管道，我们定量表征了感染和未感染细胞的众多参数。基于此，我们建立了一个预测模型，使我们能够识别宿主细胞易受感染的参数。我们发现宿主细胞易损性有两个来源：病原体诱导的细胞易感性从沙门氏菌摄取中出现并持续存在于感染过程的后期阶段;以及与细胞固有属性相关的宿主细胞固有的脆弱性，例如局部细胞拥挤和胆固醇含量。我们的方法基于形态学或分子宿主细胞参数预测单层上皮细胞中沙门氏菌感染的概率。在这里，我们提供了工作流程的详细描述，包括基于计算机的分析管道。我们的方法有可能应用于研究宿主 - 病原体相互作用的其他组合。
【背景】鼠伤寒沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌通过摄入受污染的食物或水感染宿主，引起沙门氏菌病。一旦细菌到达肠道的远端回肠，它们就会侵入广泛的宿主细胞，包括肠上皮细胞（Watson和Holden，2010）。在宿主细胞入侵的第一阶段，沙门氏菌选择其目标，使用其鞭毛游泳并扫描上皮表面（Misselwitz et ...
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| Measuring the Endocytic Recycling of Amyloid Precursor Protein (APP) in Neuro2a Cells
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Author:
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2017-12-05
[Abstract] The established primary trigger of Alzheimer’s disease’s is β-amyloid (Aβ) (Mucke and Selkoe, 2012). Amyloid precursor protein (APP) endocytosis is required for Aβ generation at early endosomes (Rajendran and Annaert, 2012). APP retention at endosomes also depends on its recycling back to the plasma membrane (Koo et al., 1996; Ubelmann et al., 2017). The following recycling assay has been optimized to assess APP recycling by live murine Neuro2a cells, a neuroblastoma cell line (Ubelmann et al., 2017).
[摘要] 已确定的阿尔茨海默病的主要诱因是β-淀粉样蛋白（Aβ）（穆克和Selkoe，2012）。淀粉样蛋白前体蛋白（APP）胞吞作用是早期内涵体产生Aβ所必需的（核内体中的APP保留还取决于其回到质膜的再循环（Koo等人，1996; Rajendran和Annaert，2012）。 Ubelmann等人，2017）。已经优化了以下回收测定法以评估活的小鼠神经母细胞瘤细胞系具有Neuro2a细胞（Ubelmann等人，2017）的APP回收。
【背景】Aβ42积聚是阿尔茨海默病的主要触发因素，APP的胞吞作用需要Aβ42代（辜和Squazzo，1994; Grbovic等人，2003; Cirrito等人，2008;拉金德伦等人，2008）内吞作用后，APP可以循环回到质膜上，可能会逃避内体的处理虽然许多研究表征了APP内吞作用，但需要建立调节。 APP回收的机制。因此，强有力的，敏感的和定量的测定是必要的。已经通过免疫荧光和定量地使用表面蛋白的批量生物素化，随后追逐内吞作用和剥离或阻断表面蛋白后的循环追踪，定性地评估APP回收（辜等，1996; Yamazaki，1996; Chaufty等，2012）。
我们使用经典的免疫荧光和半定量的细胞生物学方法，开发了用于跟踪和测量具有Neuro2a细胞中的APP回收的方法。我们的测定依赖于用红色荧光蛋白（RFP）标记的APP的瞬时表达，以检测和定量APP的细胞库和使用针对APP胞外域的抗体来选择性检测和定量表面池的运输的APP。 ...
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| Cell-free Generation of COPII-coated Procollagen I Carriers
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] The aim of this protocol is to generate COPII-coated procollagen I (PC1) carriers in a cell-free reaction. The COPII-coated PC1 carriers were reconstituted from donor membrane, cytosol, purified recombinant COPII proteins, and nucleotides. This protocol describes the preparation of donor membrane and cytosol, the assembly of the reaction, and the isolation and detection of reconstituted COPII-coated carriers. This cell-free reaction can be used to test conditions that stimulate or suppress the packaging of PC1 into COPII-coated carriers.
[摘要] 该协议的目的是在无细胞反应中产生COPII包被的前胶原I（PC1）载体。 COPII包被的PC1载体由供体膜，胞质溶胶，纯化的重组COPII蛋白和核苷酸重构。 该方案描述了供体膜和细胞溶胶的制备，反应的组装，以及复制的COPII包被的载体的分离和检测。 该无细胞反应可用于测试刺激或抑制PC1包装成COPII包被的载体的条件。
【背景】外壳蛋白复合体II（COPII）在从内质网（ER）途径到高尔基体的运输中起着至关重要的作用。来自ER的货物运输所需的基因在酵母的基因研究中被发现，并且借助于添加有纯化组分的无细胞囊泡萌芽反应来阐明囊泡出芽所需基因的蛋白质产物的精确作用（Novick 1981; Kaiser等人，1990; Barlowe等人，1994）。开发了类似的反应来检测COPII在培养的哺乳动物细胞中来自ER的货物运输中的作用（Kim等人，2005）。哺乳动物COPII包被的囊泡直径大约为80-100nm，似乎太小以至于不能容纳诸如刚性的300nm前胶原I（PC1）三股螺旋杆的大分泌性货物。尽管可能的尺寸差异，COPII对于包括PC1在内的大型货物的分泌是必不可少的（Boyadjiev等人，2006）。最近，我们报道了通过随机光学重建显微镜（STORM），相关光电子显微镜（CLEM）和活细胞成像（Gorur ...
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