| Production, Purification and Crystallization of a Prokaryotic SLC26 Homolog for Structural Studies
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Author:
Date:
2017-02-05
[Abstract] The SLC26 or SulP proteins constitute a large family of anion transporters that are ubiquitously expressed in pro- and eukaryotes. In human, SLC26 proteins perform important roles in ion homeostasis and malfunctioning of selected members is associated with diseases. This protocol details the production and crystallization of a prokaryotic SLC26 homolog, termed SLC26Dg, from Deinococcus geothermalis. Following these instructions we obtained well-folded and homogenous material of the membrane protein SLC26Dg and the nanobody Nb5776 that enabled us to crystallize the complex and ...
[摘要] SLC26或SulP蛋白构成在亲和真核生物中普遍表达的大量阴离子转运蛋白。在人类中，SLC26蛋白在离子稳态中起重要作用，选择成员的功能障碍与疾病有关。该方案详细描述了来自地热异常球菌的原核SLC26同源物（称为SLC26Dg）的产生和结晶。按照这些说明，我们获得了膜蛋白SLC26Dg和纳米体Nb5776的良好折叠和均匀的材料，使我们能够使复合物结晶并确定其结构（Geertsma等人，2015）。该方法可以适于纯化和结晶其它膜蛋白复合物。
背景 除了少数例外，膜蛋白的结构表征涉及蛋白质生产水平，洗涤剂溶解状态下的稳定化和结晶的挑战。克服这些障碍所采取的策略取决于有效选择具有优异生物化学性质的SLC26同系物和使用抗体作为结晶伴侣（Geertsma等人，2015）。这里描述的程序并没有大大偏离同事的程序，但在几点上，我们采用其他方法。例如，对于蛋白质生产，我们利用araBAD启动子（Guzman等人，1995），而不是流行的T7启动子（Studier等人，1990）。与T7启动子相反，PAD启动子允许直接调节蛋白质生产水平及其对下游折叠机械的能力的调节，从而减少包涵体的形成（Geertsma， et ...
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| Stable Transformation of Cyanobacterium Synechocystis sp.
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Author:
Date:
2014-11-05
[Abstract] Cyanobacteria are prokaryotes, which perform oxygenic photosynthesis. Among them, the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (hereafter Synechocystis) is a well characterized model system for studies on oxygenic photosynthesis, light signal transduction etc. Moreover, Synechocystis is applied in biotechnological applications (Desai and Atsumi, 2013). Stable transformation of Synechocytis is achieved via the uptake of DNA and incorporation into the host genome by homologous double recombination. This allows for the generation of gene ...
[摘要] 蓝细菌是原核生物，其执行含氧光合作用。其中，单细胞蓝细菌集胞藻 PCC 6803（下文称为"集胞藻"）是用于研究含氧光合作用，光信号转导等的良好表征的模型系统。此外，集胞藻应用于生物技术应用（Desai和Atsumi，2013）。通过DNA的吸收和通过同源双重重组并入宿主基因组中实现集胞藻的稳定转化。这允许通过用KO盒（包含由感兴趣的基因的序列片段化的选择标记）或感兴趣的基因的某些基因的稳定过表达来产生基因敲除（KO）在相应的过表达盒插入宿主基因组上的中性插入位点之后。稳定转化集胞藻由Grigorieva和Shestakov（1982）报道。从那时起，初始协议的变体已经成功应用于变换集胞藻。在这里，我们描述了成功应用于集胞藻的稳定转化的实验室方案（Schwarzkopf等人，2014）。
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