| Isolation of Murine Primary Aortic Smooth Muscle Cells
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Vascular smooth muscle cells (VSMCs) have been cultured for decades to study the role of these cells in cardiovascular disorders. The most common source of VSMCs is the rat aorta. Here we show the adaptation of this method to isolate and culture mouse aortic VSMCs. The advantage of this method is that there are many more transgenic mouse lines available compared to rats. The protocol consists of the isolation of the aorta, the liberation of vascular cells by the action of collagenase, culturing of VSCMs, and analyzing filamentous actin and alpha smooth muscle actin by fluorescence microscopy. ...
[摘要] [摘要]血管平滑肌细胞（VSMC）已培养了数十年，以研究这些细胞在心血管疾病中的作用。VSMC的最常见来源是大鼠主动脉。在这里，我们展示了此方法对分离和培养小鼠主动脉VSMC的适应性。这种方法的优点是，与大鼠相比，有更多的转基因小鼠系可用。该方案包括主动脉的分离，通过胶原酶的作用释放血管细胞，培养VSCM ，通过荧光显微镜分析丝状肌动蛋白和α平滑肌肌动蛋白。VSCM可进一步用于研究心血管疾病的潜在机制。
图形摘要：
˚F igure 1.工作步骤
关键词：血管平滑肌细胞鼠主动脉提取分离培养
[背景]血管壁细胞（壁细胞）在多种疾病的调节中起着至关重要的作用，从高血压（Rodríguez-Vita等，2005a）和动脉粥样硬化（Rodríguez-Vita等，2008）到癌症（ Wong等人，2020年），甚至最近还有COVID-19 （He等人，2020年）。毛细血管大部分被周细胞覆盖，而较大的血管在血管壁中含有VSCM。壁细胞通过血管收缩和血管舒张来控制血流。这样，吨哎是在几种药物靶，其降低血压（圣保罗等人，2020） ...
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| Activity-based Pull-down of Proteolytic Standard and Immunoproteasome Subunits
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] Activity-based probes (ABP) are small organic molecules that irreversibly bind to the active center of a specific enzyme family and may be coupled to a fluorophore or an affinity tag (Li et al., 2013). Here, we describe a method to pull-down active catalytic standard and immunoproteasome subunits in cell lysates using the biotinylated, proteasome-specific ABP Biotin-Epoxomicin (Bio-EP). Covalent labeling of the active catalytic subunits with Bio-EP is followed by a pull-down using streptavidin-coated beads. After elution from the beads, enriched subunits may be detected via Western ...
[摘要] 基于活性的探针（ABP）是不可逆地结合特定酶家族的活性中心并且可以偶联至荧光团或亲和标签的小有机分子（Li等人，2013）。在这里，我们描述了使用生物素化的蛋白酶体特异性ABP生物素 - 环氧丙素（Bio-EP）在细胞裂解物中下拉活性催化标准和免疫蛋白酶体亚基的方法。用Bio-EP共价标记活性催化亚单位，然后使用链霉抗生物素蛋白包被的珠子进行下拉。从珠中洗脱后，可以通过Western印迹，串联质谱法（Li et al。，2013）或其他技术检测富集的亚单位。
背景 蛋白酶体是存在于真核细胞的细胞核和细胞质中的桶形多分子酶复合物。蛋白质降解是重要的，包括加工MHC I呈递的抗原肽，并调节许多细胞过程（Kammerl和Meiners，2016）。在造血起源的细胞中，标准（组成型）蛋白酶体通常被免疫蛋白酶体（Meiners等人，2014）所替代，其在三种不同的催化活性β-亚基的掺入中不同（图1）。
为了研究单个催化亚基的分子功能并调节生理过程，亚基特异性蛋白酶体抑制剂的发展是必不可少的。 de ...
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