| Fluorophore Labeling, Nanodisc Reconstitution and Single-molecule Observation of a G Protein-coupled Receptor
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Activation of G protein-coupled receptors (GPCRs) by agonist ligands is mediated by a transition from an inactive to active receptor conformation. We describe a novel single-molecule assay that monitors activation-linked conformational transitions in individual GPCR molecules in real-time. The receptor is site-specifically labeled with a Cy3 fluorescence probe at the end of trans-membrane helix 6 and reconstituted in phospholipid nanodiscs tethered to a microscope slide. Individual receptor molecules are then monitored over time by single-molecule total internal reflection fluorescence ...
[摘要] 通过激动剂配体激活G蛋白偶联受体（GPCR）是通过从无活性受体构象向活性受体构象的转变来介导的。我们描述了一种新颖的单分子测定法，可以实时监测单个GPCR分子中的激活连锁构象转换。受体在跨膜螺旋6末端用Cy3荧光探针进行位点特异性标记，并在连接到显微镜载玻片的磷脂纳米圆盘中重构。然后通过单分子全内反射荧光显微镜随时间监测单个受体分子，显示无活性和活性样构象之间的自发转变。该测定提供关于无活性和活性受体构象的平衡分布以及构象交换的速率常数的信息。实验可以在不存在配体的情况下进行，显示负责基础信号传导活动的自发构象过渡，或者存在激动剂或反向激动剂配体，揭示配体如何改变受体的动力学刺激或抑制信号传导活性。所得到的机械信息对于改进的GPCR靶向药物的设计是有用的。单分子测定法在β2肾上腺素能受体的背景下进行了描述，但可扩展到多种GPCRs。
【背景】GPCR介导本地和远距离的细胞通讯，特别是内分泌系统。例如，细胞对激素如肾上腺素的反应是通过肾上腺素能受体介导的，其中β2肾上腺素能受体（β2AR）是突出的成员。 ...
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| Examination of the Interaction between a Membrane Active Peptide and Artificial Bilayers by Dual Polarisation Interferometry
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Author:
Date:
2017-01-05
[Abstract] Examining the interaction of peptides with lipid bilayers to determine binding kinetics is often performed using surface plasmon resonance (SPR). Here we describe the technique of dual polarisation interferometry (DPI) that provides not only information on the kinetics of the peptide binding to the bilayer, but also how the peptide affects the lipid order of the bilayer.
[摘要] 检查肽与脂质双层相互作用以确定结合动力学通常使用表面等离子体共振（SPR）进行。在这里，我们描述了双极化干涉测量技术（DPI），它不仅提供了结合双层的肽的动力学信息，而且还提供肽如何影响双层的脂质顺序。
背景 寻求新药开发有效治疗耐药性感染是一个严重的挑战。一组分子，抗菌肽，由于其对细菌，真菌和癌细胞的活性范围，显示出有希望的有效的新疗法（Mader和Hoskin，2006; van der Weerden等人，2013） ）。抗菌肽的细胞杀伤能力通常涉及与膜的相互作用（Brogden，2005; Zasloff，2002）。为了开发这些肽作为有效的治疗剂，我们需要了解肽与细胞膜的相互作用的性质以及为什么这种相互作用导致细胞死亡。也就是说，我们需要实时了解肽和膜之间发生的全部事件序列;从肽与双层的初始静电相互作用到磷脂选择性，到膜的最终破坏，包括脂质顺序的变化。
＆nbsp;大多数检查肽 - 脂质相互作用的技术在整个过程中提供信息的能力有限。例如，表面等离子体共振（SPR）实时提供结合数据，但不显示肽结合如何影响膜结构（Green et al。，2000; ...
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