| Expression and Purification of a Mammalian P2X7 Receptor from Sf9 Insect Cells
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] The P2X7 receptor is an extracellular ATP-gated ion channel found only in eukaryotes (Bartlett et al., 2014). Due to its unique properties among P2X receptors, such as formation of a large conductance pore, the P2X7 receptor has been implicated in devastating diseases like chronic pain (North and Jarvis, 2013). However, mechanisms underlying the P2X7 specific properties remain poorly understood, partly because purification of this eukaryotic membrane protein has been challenging. Here we describe a detailed protocol for expressing and purifying a mammalian P2X7 receptor using an ...
[摘要] P2X7受体是仅在真核生物中发现的胞外ATP门控离子通道（Bartlett等，2014）。由于其P2X受体之间的独特性质，例如大电导孔的形成，P2X7受体已经涉及破坏性疾病如慢性疼痛（North和Jarvis，2013）。然而，P2X7特异性属性的机制仍然知之甚少，部分原因是纯化这种真核膜蛋白是一个挑战。在这里，我们描述了使用昆虫细胞 - 杆状病毒系统表达和纯化哺乳动物P2X7受体的详细方案。 P2X7受体在作为GFP融合蛋白的Sf9昆虫细胞中表达，并用含有Triton X-100洗涤剂的缓冲液溶解。然后使用Strep-Tactin亲和层析在含有十二烷基麦芽糖苷的缓冲液中纯化P2X7-GFP融合蛋白。在通过凝血酶酶切割连接的GFP和Strep-标签后，使用大小排阻色谱分离P2X7受体。该方法通常从6L的Sf9培养物产生约2mg的纯化蛋白质。纯化的蛋白质可以用含有15％甘油的缓冲液在4℃下储存至少2个月，并用于各种功能和结构研究（Karasawa和Kawate，2016）。
【背景】P2X7受体是嘌呤能P2X受体家族的七种亚型之一，并且是广泛疾病如神经退行性疾病，癫痫和神经性疼痛的有希望的新型药物靶点（North和Jarvis，2013; Bhattacharya和Biber， ...
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| Isolation of Ribosomal Particles from the Unicellular Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Isolation of ribosomal particles is an essential step in the study of ribosomal components as well as in the analysis of trans-acting factors that interact with the ribosome to regulate protein synthesis and modulate the expression profile of the cell in response to different environmental conditions. In this protocol, we describe a procedure for the isolation of 70S ribosomes from the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (hereafter Synechocystis). We have successfully used this protocol in our study of the cyanobacterial ribosomal-associated ...
[摘要] 核糖体颗粒的分离是研究核糖体组分以及与核糖体相互作用以调节蛋白质合成并调节细胞表达谱的反式因子的分析中必不可少的步骤响应不同的环境条件。在本协议中，我们描述了从单细胞蓝细菌集胞藻分离70S核糖体的过程。 PCC 6803（以下简称集胞藻）。我们已经成功地使用这个方案来研究蓝细菌核糖体相关蛋白LrtA，它是细菌HPF（冬眠促进因子）的同系物（Galmozzi等人，2016）。
背景 据报道蓝藻核糖体几乎没有生物化学研究。已经通过差速离心分离70S核糖体颗粒，然后通过二维电泳分析核糖体蛋白质（Sato et al。，et al。 ，1998）。核糖体也已经从聚球藻（Spechococcus）进行制备。 PCC 6301细胞使用组合差速离心和蔗糖步骤梯度的方案（Sugita等人，2000）。通过差速离心分离细胞提取物也被用于制备核糖体样品用于在不同的聚球藻菌株中开发体外翻译系统（Mutsuda和Sugiura，2006 ）。基于针对聚球藻（Sugita等人，2000）所述的方法，本文所述的针对集胞藻的方法允许使用以下方式纯化核糖体颗粒线性蔗糖梯度的超速离心。
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| Fusarium graminearum Maize Stalk Infection Assay and Associated Microscopic Observation Protocol
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] The ascomycete fungus Fusarium graminearum (previously also called Gibberella zeae) causes Gibberella stalk rot in maize (Zea mays) and results in lodging and serious yield reduction. To develop methods to assess the fungal growth and symptom development in maize stalks, we present here a protocol of maize stalk inoculation with conidiospores of fluorescent protein-tagged F. graminearumand microscopic observation of the stalk infection process. The inoculation protocol provides repeatable results in stalk rot symptom development, and allows ...
[摘要] 子囊菌真菌禾本科禾谷镰菌（以前也称为玉蜀黍赤霉）导致玉米（ Zea mays ）中的赤霉菌并导致倒伏和严重的产量降低。为了开发方法来评估玉米茎的真菌生长和症状发展，我们在这里提出玉米茎接种与荧光蛋白标记的F的分生孢子的协议。禾谷镰刀菌和茎显影观察茎感染过程。该接种方案在茎腐病症发展中提供可重复的结果，并且允许跟踪在细胞规模的玉米茎中的真菌菌丝生长。
关键字： 镰孢镰孢茎侵蚀，植物真菌病原体，接种。
[背景] 玉米（ Zea mays ）是整个土壤中最重要的作物之一世界。茎是玉米植物的主茎。它由节点和节点组成（图1）。节间包括皮和髓，并且血管组织分散在髓中。图1显示了在明场或GFP荧光通道下的玉米茎部分的显微图像。这为玉米秆接种和观察提供了背景。 子囊菌真菌禾本科镰刀菌（以前也称为玉蜀黍赤霉）会导致玉米中的赤霉菌腐烂（ Zea mays >），并导致倒伏和产量损失（Jackson等人，2009; Santiago等人，2007）。 ...
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