| In vitro NLK Kinase Assay
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions to perform an in vitro kinase assay for nemo-like kinase. In addition, this protocol also describes an efficient method using mild lysis buffer for expression and purification of Glutathione S-transferase (GST) fusion proteins.
[摘要] 该协议提供了一步一步的指导，以进行nemo样激酶的体外激酶测定。 此外，该方案还描述了使用温和裂解缓冲液来表达和纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白的有效方法。
【背景】果蝇nemo已经被确定为在发育中的果蝇眼中光感受器簇的关键调节剂（Choi和Benzer，1994）。 据报道，nemo是不同物种间保守的。 该哺乳动物同系物是类似于Nemo的激酶（NLK）（Brott等人，1998; Rocheleau等人，1999）。 NLK是CMGC集团（CDK，MAPK，GSK3和CLK）的成员，也属于非典型的MAPK家族。 NLK通过转录因子调节多种细胞机制，所述转录因子包括在不同信号传导途径中的关键参与者TCF / LEF1，NICD和FOXO（Ishitani等人，1999; Ishitani等人， ，2010; Kim等人，2010）。 此外，最近我们已经将NLK鉴定为Yes相关蛋白（YAP）的新型激酶，YAP是Hippo途径中的共转录激活剂（Moon等人，2017）。 该协议描述了用于测量类似尼莫地来激酶活性的体外方法。
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| Affinity Purification of the RNA Degradation Complex, the Exosome, from HEK-293 Cells
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] The RNA exosome complex plays a central role in RNA processing and regulated turnover. Present both in cytoplasm and nucleus, the exosome functions through associations with ribonucleases and various adapter proteins (reviewed in [Kilchert et al., 2016]). The following protocol describes an approach to purify RNA exosome complexes from HEK-293 cells, making use of inducible ectopic expression, affinity capture, and rate-zonal centrifugation. The obtained RNA exosomes have been used successfully for proteomic, structural, and enzymatic studies (Domanski et al., 2016).
[摘要] RNA外植体复合物在RNA加工和调节营养中起核心作用。在细胞质和细胞核中存在，外来体通过与核糖核酸酶和各种衔接蛋白的关联起作用（参见[Kilchert等人，2016]）。以下方案描述了从HEK-293细胞中纯化RNA外来体复合物的方法，利用可诱导的异位表达，亲和力捕获和速率 - 区带离心。所获得的RNA外来体已被成功地用于蛋白质组学，结构和酶学研究（Domanski等人，2016）。
在我们以前的工作中，我们建立了在四环素诱导型CMV启动子（HEK-293 Flp-In T-REx-Thermo Fisher）的控制下表达C末端3xFLAG标记的外来体组分EXOSC10（RRP6）的同基因HEK-293细胞系科学）。该系统允许我们以与内源WT蛋白质相当的水平表达标记的EXOSC10蛋白质，并且使用磁性抗FLAG亲和介质和来源于冷冻细胞粉末的蛋白质提取物来研究外来体纯化方案（Domanski等， / em>。，2012）。进一步探索使用的蛋白质提取条件，我们开发了一种允许在亲和捕获的外来体内保留DIS3（RRP44）的方案，否则证明是困难的（Hakhverdyan等人，2015）。基于这些研究，我们通过使用甘油密度梯度的速率区带离心法进一步纯化了RNA外来体（+/- DIS3）（Domanski等人，2016）。虽然蛋白质提取物中洗涤剂CHAPS（3 - ...
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| RNA Degradation Assay Using RNA Exosome Complexes, Affinity-purified from HEK-293 Cells
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] The RNA exosome complex plays a central role in RNA processing and regulated turnover. Present both in cytoplasm and nucleus, the exosome functions through associations with ribonucleases and various adapter proteins (reviewed in [Kilchert et al., 2016]). The RNA exosome-associated EXOSC10 protein is a distributive, 3’-5’ exoribonuclease. The following protocol describes an approach to monitor the ribonucleolytic activity of affinity-purified EXOSC10-containing RNA exosomes, originating from HEK-293 cells, as reported in (Domanski et al., 2016) and further detailed in the ...
[摘要] RNA外植体复合物在RNA加工和调节营养中起核心作用。在细胞质和细胞核中存在，外来体通过与核糖核酸酶和各种衔接蛋白的关联起作用（参见[Kilchert等人，2016]）。 RNA外植体相关的EXOSC10蛋白是分布的3'-5'外核糖核酸酶。以下方案描述了监测源自HEK-293细胞的亲和纯化含EXOSC10的RNA外来体的核糖核酸裂解活性的方法，如（Domanski等人，2016）所报道的，并进一步详细描述这个配套生物协议（Domanski和LaCava，2017）。
在我们以前的工作中，我们在四环素诱导型CMV启动子（HEK-293 Flp-In T-REx-Thermo）的控制下，建立了表达C末端3xFLAG标记的外来体成分EXOSC10（RRP6）的同基因HEK-293细胞系费雪科学）。该系统允许我们以与内源WT蛋白质相当的水平表达标记的EXOSC10蛋白质，并且使用磁性抗FLAG亲和介质和来源于冷冻细胞粉末的蛋白质提取物来研究外来体纯化方案（Domanski等， / ...
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