Antisense Oligonucleotide-mediated Knockdown in Mammary Tumor Organoids
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Date:
2017-08-20
[Abstract] Primary mammary tumor organoids grown in 3D are an excellent system to study tumor biology. They resemble the organization and physiology of native epithelia more closely than cancer cell lines grown in 2D, and additionally model interactions with the ECM (Boj et al., 2015; Clevers, 2016; Shamir and Ewald, 2014). Mammary tumor organoids are therefore a promising model system to identify and characterize novel drivers of breast cancer that would be unlikely to be identified using 2D cell lines. Antisense oligonucleotides can be used to efficiently and specifically knockdown target ...
[摘要] 在3D生长的原发性乳腺肿瘤组织是研究肿瘤生物学的优秀系统。 它们类似于天然上皮的组织和生理学,比2D生长的癌细胞系更为紧密,另外还与ECM的模型相互作用(Boj et al。,2015; Clevers,2016; Shamir and Ewald,2014)。 因此,乳腺肿瘤组织因子是一种有希望的模型系统,用于识别和表征不可能使用2D细胞系识别的乳腺癌的新型驱动因素。 反义寡核苷酸可用于有效和特异地敲低细胞中的靶基因(Bennett等,2017)。 它们可以被有机物自由摄取,而不需要转染剂,使其成为常规实验室研究和筛选的便捷工具。 【背景】乳腺癌是全世界妇女中最常见的恶性肿瘤,是妇女癌症死亡率的第二大原因(Siegel等,2017)。为了改善现有的治疗方案,确定和调查具有预防乳腺癌进展潜力的新分子靶标至关重要。我们应用RNA-seq来产生与正常乳腺上皮细胞相比在原发性乳腺肿瘤中失调的长非编码RNA(lncRNA)的综合目录,并将30个先前未表征的lncRNA作为乳腺肿瘤相关RNA(MaTARs)进行优先排序。为了功能评估MaTARs作为肿瘤进展的关键驱动因素,我们对3D乳腺肿瘤组织中的所有30个MaTARs进行了反义寡核苷酸(ASO)介导的敲低分析(Diermeier等,2016)。 ASO是短(20-mers),含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链DNA分子以及2'-ribose(5-10-5 ...
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Mouse CD8+ T Cell Migration in vitro and CXCR3 Internalization Assays
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Chemokines are molecules that regulate the positioning of cells during homeostasis and inflammation. CXCL10 is an interferon-induced chemokine that attracts cells that express the chemokine receptor CXCR3 on their surface. CXCL10 expression is often induced upon inflammation and guides lymphocytes, such as T and NK cells, into the injured tissues. Notably, CXCL10 binding to CXCR3 induces receptor internalization and, therefore, low CXCR3 levels in cells positive for CXCR3 expression can be indicative of chemokine signaling.
Here, we describe an in vitro method to evaluate ...
[摘要] 趋化因子是调节体内平衡和炎症期间细胞定位的分子。 CXCL10是干扰素诱导的趋化因子,其吸引在其表面上表达趋化因子受体CXCR3的细胞。 CXCL10表达通常在炎症诱导并引导淋巴细胞如T和NK细胞进入受损组织。值得注意的是,CXCL10与CXCR3结合诱导受体内化,因此CXCR3表达阳性细胞中的CXCR3水平降低可能是趋化因子信号传导的指示。  这里,我们描述体外方法来评估鼠CD8 + T细胞向重组鼠CXCL10迁移的能力;以及暴露于不同剂量的趋化因子后在T细胞表面测量CXCR3表达水平的流式细胞术测定。
背景 趋化因子介导的T细胞运输是稳态和炎症期间的重要过程。活化的CD8 + T细胞表达趋化因子受体,例如CXCR3,允许它们向趋化因子CXCL9,10和11迁移,通常在损伤组织上上调。调节T细胞迁移的分子线索的评估对于了解其功能背后的生物学非常重要,但是在体内运行的复杂机制有时难以去卷积。在这里,我们提供有关体外方法的详细信息,以评估CD8 + T细胞上的趋化因子功能,重点是CXCL10介导的化学吸引和CXCR3内化。我们使用可以容易地在体外扩增和活化的抗原特异性转基因CD8 +细胞,因此提供足够数量的表型相同的淋巴细胞(例如, ...
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Isolation of Highly Pure Primary Mouse Alveolar Epithelial Type II Cells by Flow Cytometric Cell Sorting
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Date:
2016-11-20
[Abstract] In this protocol, we describe the method for isolating highly pure primary alveolar epithelial type II (ATII) cells from lungs of naïve mice. The method combines negative selection for a variety of lineage markers along with positive selection for EpCAM, a pan-epithelial cell marker. This method yields 2-3 x 106 ATII cells per mouse lung. The cell preps are highly pure and viable and can be used for genomic or proteomic analyses or cultured ex vivo to understand their roles in various biological processes.
[摘要] 在这个协议,我们描述从初始小鼠的肺分离高纯度原发性肺泡上皮细胞类型(ATII)细胞的方法。该方法结合对多种谱系标志物的阴性选择以及对于Ep上皮细胞标记物EpCAM的阳性选择。该方法每小鼠肺产生2-3×10 6个ATII细胞。细胞制品是高度纯的和可行的,并且可以用于基因组或蛋白质组分析或培养离体以了解他们在各种生物过程中的作用。 [背景] 肺的内表面由上皮细胞排列,上皮细胞的类型在形态上和功能上随着肺内的位置而变化。 ATII细胞是两种类型的上皮细胞中的一种,其排列在肺泡壁上并且已经被描述为在表面活性剂合成和分泌中起关键作用。它们也是肺内第一道防线的一部分,并且涉及在肺部感染或过敏期间引发和调节免疫应答。它们还被认为在远端肺中充当具有增殖能力和损伤后修复上皮的能力的祖细胞。 ATII分离的可用方法不产生超过80-85%纯度的细胞制品,使得它们不适合于mRNA和蛋白质表达的可靠分析。本文所述的方法是对现有方法的改进,并产生具有最高纯度的小鼠原代ATII细胞制备物,因此可以可靠地用于表达分析。对于该方法的进一步讨论,我们将读者指向该协议起源的原始出版物(Sinha等人,2016)。
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