| K+ Release Assay and K+ Measurement in Oocyte Assay
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Author:
Date:
2020-11-05
[Abstract] The Xenopus oocyte is a powerful system for the exogenous expression and functional characterization of plant membrane transport proteins. Until now, a number of potassium transporters and channels have been identified in oocytes expression system by the two-electrode voltage clamp technology. It is difficult to characterize K+/H+ anti-transporters, especially, electroneutral transporter. The K+ efflux assay system enables easy, fast, large-scale measurement of the transporters activity without two-electrode voltage clamp technology. This protocol ...
[摘要] [摘要]爪蟾卵母细胞是针对外源表达和植物膜转运蛋白的功能表征一个强大的系统。迄今为止，通过两电极电压钳技术已经在卵母细胞表达系统中发现了许多钾转运蛋白和钾通道。很难表征K + / H +反转运蛋白，尤其是电中性转运蛋白。K +外排测定系统无需两电极电压钳技术即可轻松，快速，大规模地测量转运蛋白的活性。该协议描述了一种测量卵母细胞表达系统中钾转运蛋白外排活性的技术。
[背景[非洲爪蟾卵母细胞中积累了酶，蛋白质和细胞器，这些都可以被利用来生产大量，正确翻译后修饰，正确定点的外来蛋白质（Miller and Zhou，2000）。因此，卵母细胞通过使用两电极电压钳技术提供了一种有效的表达系统，以功能上表征植物膜蛋白。在卵母细胞中表达的第一个植物钾转运蛋白是K +通道（Cao等，1992）。此后，大部分钾通道和转运已经在卵母细胞的研究（Schachtman等人，1994; V é RY等人，1994; Wang和吴，2013年）。但是一些K + / H +反转运蛋白是电中性的，两电极电压钳技术无法表征这些转运蛋白。为了克服这个问题，我们采用了一种新的方法来确定这些转运蛋白的活性，方法是测量孵育前后培养基中钾含量的变化。细胞内ķ +浓度为约70 - 150mM的（韦伯，1999年）。由表达的K +转运蛋白介导的K +外排可引起细胞内和细胞外K ...
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| Biochemical Analysis of Dimethyl Suberimidate-crosslinked Yeast Nucleosomes
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Nucleosomes are the fundamental unit of eukaryotic chromosome packaging, comprised of 147 bp of DNA wrapped around two molecules of each of the core histone proteins H2A, H2B, H3, and H4. Nucleosomes are symmetrical, with one axis of symmetry centered on the homodimeric interaction between the C-termini of the H3 molecules. To explore the functional consequences of nucleosome symmetry, we designed an obligate pair of H3 heterodimers, termed H3X and H3Y, allowing us to compare cells with single or double H3 alterations. Our biochemical validation of the heterodimeric X-Y interaction included ...
[摘要] 核小体是真核染色体包装的基本单元，由围绕核心组蛋白H2A，H2B，H3和H4中的每一个的两个分子包裹的147bp DNA组成。 核小体是对称的，一个对称轴以H3分子的C-末端之间的同源二聚体相互作用为中心。 为了探索核小体对称性的功能性后果，我们设计了一对特异性H3异二聚体，称为H3X和H3Y，使我们能够比较具有单一或双重H3改变的细胞。 我们对异二聚体X-Y相互作用的生物化学验证包括使用二甲基琥珀三酸酯（DMS）进行的核内H3交联。 在这里，我们提供了使用DMS来分析酵母核小体的详细方案。
【背景】组蛋白的翻译后修饰影响染色体生物学的各个方面，包括转录，复制，修复和重组。因为核小体包含每个核心组蛋白的两个拷贝，所以修饰可以是对称的（在两个H3尾部上的相同修饰，例如，在核小体内的两个H3尾部上的K27me（Voigt等人
对于单个核小体内H3X-H3Y相互作用的生化验证，我们生成了表达细菌生物素连接酶BirA，N-末端V5-标记的H3X和N-末端生物素接受表位标记的H3Y的酵母菌株（Beckett等人， 1999）。 ...
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| Conditional Knockdown of Proteins Using Auxin-inducible Degron (AID) Fusions in Toxoplasma gondii
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Toxoplasma gondii is a member of the deadly phylum of protozoan parasites called Apicomplexa. As a model apicomplexan, there is a great wealth of information regarding T. gondii’s 8,000+ protein coding genes including sequence variation, expression, and relative contribution to parasite fitness. However, new tools are needed to functionally investigate hundreds of putative essential protein coding genes. Accordingly, we recently implemented the auxin-inducible degron (AID) system for studying essential proteins in T. gondii. Here we provide a step-by-step protocol ...
[摘要] 弓形虫是原生动物寄生虫称为Apicomplexa致命门的一员。 作为一个复杂的模型，关于T的信息有很多。 gondii的8,000多种蛋白质编码基因，包括序列变异，表达和对寄生虫适应的相对贡献。 然而，需要新的工具来功能性地调查数百个推定的必需蛋白质编码基因。 因此，我们最近实施了生长素诱导降解（AID）系统来研究T中的基本蛋白质。弓形虫。 在这里，我们提供了一个检查蛋白质功能的一步一步的协议。 在组织培养环境中使用AID系统。
【背景】生长素是一类通过靶向某些蛋白质在植物中进行蛋白酶体降解而发出信号的植物激素（Teale等人，2006）。 Kohei Nishimura等人具有将该植物特异性信号传导系统的组分转移到其他真核生物中用于有兴趣的蛋白质（POI）的条件调节，创建生长素诱导降解（AID）系统的聪明想法（Nishimura等人，2009）。这个系统已经被成功地用于几种真核生物，包括疟原虫疟原虫（Kreidenweiss et al。，2013; Philip和Waters，2015）。只需要两个转基因成分来实现这个系统，称为转运抑制剂反应1（TIR1）的植物生长素受体和用AID标记的POI。用生长素（例如，3-吲哚乙酸/ IAA）处理活化SCF ...
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