| Real-time Base Excision Repair Assay to Measure the Activity of the 8-oxoguanine DNA Glycosylase 1 in Isolated Mitochondria of Human Skin Fibroblasts
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Author:
Date:
2021-03-20
[Abstract] 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG) is one of the most common and mutagenic oxidative DNA damages induced by reactive oxygen species (ROS). Since ROS is mainly produced in the inner membranes of the mitochondria, these organelles and especially the mitochondrial DNA (mtDNA) contained therein are particularly affected by this damage. Insufficient elimination of 8-oxoG can lead to mutations and thus to severe mitochondrial dysfunctions. To eliminate 8-oxoG, the human body uses the enzyme 8-oxoguanine DNA glycosylase 1 (OGG1), which is the main antagonist to oxidative damage to DNA. However, ...
[摘要] [摘要] 7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤（8-oxoG）是由活性氧（ROS）引起的最常见且诱变的氧化DN A损伤之一。由于ROS主要在线粒体的内膜中产生，因此这些细胞器，特别是其中所含的线粒体DNA（mtDNA）受到这种损害的特别影响。消除8-oxoG可能会导致突变，从而导致严重的线粒体功能障碍。为了消除8-oxoG，人体使用了8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶1（OGG1），它是DNA氧化损伤的主要拮抗剂。但是，先前的研究表明，人类OGG1的活性（h OGG1）随着年龄的增长而减少，导致与年龄相关的8-oxoG积累。更好地了解hOGG1的确切机制可能会导致发现新的靶标，因此对于开发预防性疗法具有重要意义。因此，我们开发了一种实时碱基切除修复测定法，该测定法采用了专门设计的双链报告寡核苷酸来测量分离的线粒体裂解物中hOGG1的活性。这里介绍的该系统与经典测定法不同，在经典测定法中，可以通过实时测量hOGG1活性通过变性丙烯酰胺凝胶进行终点测定。另外，为了确定该双功能酶的每个酶促步骤的活性（N-糖基化酶和AP-裂解酶活性），还可以进行解链曲线分析。使用各种离心步骤从人成纤维细胞中分离线粒体后，将其裂解，然后与专门设计的报告寡核苷酸一起孵育。hOGG1活性的后续测量是在常规实时PCR系统中进行的。
[背景]人体是永久的损害案例。每天约10 ...
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| Sequencing of Ebola Virus Genomes Using Nanopore Technology
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] Sequencing of virus genomes during disease outbreaks can provide valuable information for diagnostics, epidemiology, and evaluation of potential countermeasures. However, particularly in remote areas logistical and technical challenges can be significant. Nanopore sequencing provides an alternative to classical Sanger and next-generation sequencing methods, and was successfully used under outbreak conditions (Hoenen et al., 2016; Quick et al., 2016). Here we describe a protocol used for sequencing of Ebola virus under outbreak conditions using Nanopore technology, which we ...
[摘要] 病毒基因组在疾病爆发期间的测序可以为诊断，流行病学和潜在对策的评估提供有价值的信息。然而，特别是在偏远地区，后勤和技术挑战可能很大。纳米孔测序提供了经典的Sanger和下一代测序方法的替代物，并且在爆发条件下成功使用（Hoenen等人，2016; Quick等人，2016 ）。在这里我们描述了用于在爆发条件下使用纳米孔技术对埃博拉病毒进行测序的方案，我们在CDC/NIH诊断实验室（de Wit等人，2016）成功地实施了ELWA- 3 确定病毒基因组的全长序列是必不可少的，因为它是在利比里亚蒙罗维亚的埃博拉病毒治疗股在最近在西非爆发的埃博拉病毒爆发期间。
<病毒学中的程序。虽然经典的方法涉及sanger测序后引物步行战略，较新的方法涉及使用下一代测序方法，如454，illumina或ion torrent技术。所有这些技术的常见问题，尽管它们的许多优点，是所需的仪器是大的，昂贵的，脆弱的，因此难以运输。此外，经常涉及文库制备程序。虽然在通常情况下这些问题没有什么影响，因为这些机器在具有优良基础设施的专门实验室中运行，在偏远地区的病毒爆发期间（例如在埃博拉病毒爆发的情况下），这可能造成重大问题，特别是在样品出口从受影响的地区到这些专门的实验室往往在政治和后勤方面具有挑战性。在这些情况下，可以容易和快速地部署到偏远地区，并允许在爆发区域直接进行测序的测序技术的可用性是非常有价值的。因此，我们已经在monrovia的elwa-3埃博拉病毒治疗单元的现场诊断实验室测试了minion测序装置，该装置当时正在由oxford="" nanopore="" technologies（ont）开发。（de="" wit等人，/em="">。，2016），并且制定了在这些条件下快速产生埃博拉病毒的全长序列的方案。该装置使用纳米孔，核苷酸链通过其以受控的方式运输。核苷酸阻断并因此调节流过这些孔的离子流，这取决于通过纳米孔的核苷酸的物理性质，并且这些电流调节通过装置测量并翻译成核苷酸序列。该测试的结果表明该技术确实显示出作为可快速部署和高度可用的测序平台的巨大前景，其在其他地方是可用的（Hoenen等人，2016），以及类似的使用与Quick自己的努力独立地执行的相同测序平台进行的测试。 （2016年）。
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