| Generation and Implementation of Reporter BHK-21 Cells for Live Imaging of Flavivirus Infection
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Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] The genus Flavivirus within the family Flaviviridae includes many viral species of medical importance, such as yellow fever virus (YFV), Zika virus (ZIKV), and dengue virus (DENV), among others. Presently, the identification of flavivirus-infected cells is based on either the immunolabeling of viral proteins, the application of recombinant reporter replicons and viral genomes, or the use of cell-based molecular reporters of the flaviviral protease NS2B-NS3 activity. Among the latter, our flavivirus-activatable GFP and mNeptune reporters contain a quenching peptide (QP) joined to the ...
[摘要] [摘要]本属黄病毒家族中的黄病毒包括医学重要性许多病毒种类，如黄热病病毒（YFV），寨卡病毒（ZIKV）和登革热病毒（DENV），等等。目前，黄病毒感染细胞的鉴定是基于病毒蛋白的免疫标记，重组报告子复制子和病毒基因组的应用，或黄病毒蛋白酶NS2B-NS3活性的基于细胞的分子报告子的使用。在后者中，我们的黄病毒可激活的GFP和mNeptune报道分子含有通过接头连接到荧光蛋白的淬灭肽（QP），该接头由黄病毒NS2B - NS3蛋白酶（AAQRRGRIG）的切割位点组成。当病毒蛋白酶切割接头时，淬灭肽被去除，并且荧光蛋白采用促进荧光的构象。在这里，我们提供了用于表达，选择和实施表达黄病毒基因编码分子报告子的稳定BHK-21细胞的详细协议，适用于通过活细胞成像监测病毒感染。我们还将描述图像分析过程并提供所需的软件管道。我们的报告细胞允许通过活细胞成像对黄病毒的参考菌株和天然菌株实施单细胞感染动力学以及噬菌斑测定。
图形摘要：
黄病毒感染实时成像的报告基因BHK-21细胞的产生与实施工作流。
[背景]黄病毒代表了正在引起并正在重新出现的全球性威胁，可能引起动物和人类疾病，包括许多与医学有关的病毒，例如黄热病病毒（YFV），西尼罗河病毒（WNV），日本脑炎病毒（JEV），登革热病毒（DENV），并兹卡六RUS（ZIKV），等等（摹·乌尔德·所罗门，2008） ...
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| Alphavirus Purification Using Low-speed Spin Centrifugation
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Date:
2018-03-20
[Abstract] Chemical and sedimentation procedures are used to purify virus particles. While these approaches are successful for wild-type viruses, they are often not feasible for purifying mutant viruses with assembly defects. We combined two published methods (Atasheva et al., 2013; Moller-Tank et al., 2013), to generate a protocol that uses low-speed centrifugation to purify both wildtype and mutant enveloped virus particles at high yield with minimal handling steps. This protocol has successfully been used to purify alphavirus particles for imaging and structural studies (Wang et al. ...
[摘要] 化学和沉淀过程用于纯化病毒颗粒。 虽然这些方法对于野生型病毒是成功的，但它们通常不能用于纯化具有装配缺陷的突变病毒。 我们结合了两种公开的方法（Atasheva等人，2013; Moller-Tank等人，2013），以生成使用低速离心纯化两种方法的方案 野生型和突变体包膜病毒颗粒，产量高，处理步骤最少。 该方案已成功用于纯化甲病毒颗粒用于成像和结构研究（Wang等人，2015; Ramsey等人，2017）。
【背景】传统上，病毒纯化基于化学沉淀（例如PEG）或密度梯度离心。离心方案包括以高速（>100,000μgx g）或通过沉淀基质如铯，Nycodenz，碘克沙醇，蔗糖，甘油或酒石酸丸粒化颗粒。在梯度沉降之后，纯化的病毒样品通常需要额外的步骤来除去梯度基质，浓缩纯化的颗粒，并且缓冲液交换成用于下游应用的稳定缓冲液。这些方法包括透析，通过离心过滤器离心或PEG沉淀。虽然这些方法会产生纯化的颗粒，但有几个缺点：（1）总产量可能很低，（2）纯化所需的时间可能延长到一周，（3）形态上不均匀的颗粒不能以相同的效率纯化，（ 4）过程中可能会损坏颗粒，以及（5）组装突变体常常不能在净化过程中存活，使得某些下游分析具有挑战性。
这里描述的协议使用温和的方法来净化包膜病毒颗粒。我们使用最小的离心力来减少对粒子的损伤，这是由于负染透射电子显微镜（TEM）中增加的形态异质性或通过TEM或传染性测定法测定的易碎粒子的全部损失而观察到的。另外，我们希望减少纯化后纯化病毒体的操作。通过合并文献中的两个方案（Atasheva等人，2013; ...
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| Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection
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Author:
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2017-11-20
[Abstract] Over the past 15 years, the free-living nematode, Caenorhabditis elegans has become an important model system for exploring eukaryotic innate immunity to bacterial and fungal pathogens. More recently, infection models using either natural or non-natural nematode viruses have also been established in C. elegans. These models offer new opportunities to use the nematode to understand eukaryotic antiviral defense mechanisms. Here we report protocols for the infection of C. elegans with a non-natural viral pathogen, vesicular stomatitis virus (VSV) through ...
[摘要] 在过去的15年中，线虫自由生活已经成为探索真核细菌和真菌病原体真核免疫的重要模型系统。 最近，使用天然或非天然线虫病毒的感染模型也已经在C中建立。线虫。 这些模型提供了使用线虫了解真核抗病毒防御机制的新机会。 在这里，我们报告感染的协议。 线虫与非天然病毒病原体，水泡性口炎病毒（VSV）通过显微注射。 我们还描述了编码荧光或萤光素酶报告基因的重组VSV毒株如何与简单的基于荧光，存活和发光的分析结合使用来鉴定宿主遗传背景，并对病毒感染有不同的易感性。
【背景】由于它的遗传易用性，体积小，文化价廉，透明的身体，自由生活的线虫秀丽隐杆线虫作为模式生物提供了许多优点。此外，C的易感性。线虫对人类多种细菌和真菌病原体的作用使得这种蠕虫成为研究微生物发病机制的有吸引力的系统（Zhang和Hou，2013; Cohen and Troemel，2015）。最近，发现了正义ssRNA奥赛病毒（OV）作为第一种天然的病毒病原体。线虫已经提示使用OV- C。 elegans 模型来定义线虫抗病毒防御机制（Felix等人，2011; Gammon，2017）。这些研究已经证明了线虫抗病毒RNA干扰途径组分如Dicer相关解旋酶1（DRH-1）在限制病毒复制中的明确作用（Ashe等人，2013）。
为了补充OV模型系统，我们最近报道了新一代病毒的产生。使用反义ssRNA水泡性口炎病毒（VSV）（Gammon等人，2017）的线虫模型。用VSV感染野生型（N2）蠕虫是致命的，虽然抗病毒反应（例如突变体，drh-1突变体）突变体缺陷会更快地感染感染（Gammon ...
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