| Advanced Design of Minimalistic Dumbbell-shaped Gene Expression Vectors
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Minimal DNA vectors exclusively comprising therapeutically relevant sequences hold great promise for the development of novel therapeutic regimen. Dumbbell-shaped vectors represent non-viral non-integrating DNA minimal vectors which have entered an advanced stage of clinical development (Hardee et al., 2017). Spliceable introns and DNA nuclear import signals such as SV40 enhancer sequences are molecular features that have found multiple applications in plasmid vectors to improve transgene expression. In dumbbells however, effects triggered by introns were not investigated and ...
[摘要] 唯一包含治疗相关序列的最小DNA载体对于新型治疗方案的发展具有很大的希望。哑铃型载体代表已经进入临床发展的晚期阶段的非病毒非整合DNA最小载体（Hardee等人，2017）。可接合的内含子和DNA核输入信号如SV40增强子序列是在质粒载体中发现多个应用以改善转基因表达的分子特征。然而，在哑铃中，由内含子引发的效应未被研究，基于DNA的核导入序列尚未发现应用，可能是因为哑铃载体在尺寸上不断被最小化。我们调查内含子和/或SV40增强子衍生序列对哑铃载体驱动的报告基因表达的影响。发现可拼接内含子的实现在所有研究的细胞系中无条件地增强基因表达。相反，SV40增强子的使用改善了细胞类型依赖性的基因表达。虽然这两个特征显着增加哑铃载体大小，但内含子和增强子或两者的组合都不会对基因表达产生负面影响。相反，与质粒或对照哑铃相比，这两个特征在一起改善了哑铃驱动的基因表达，高达160-或56倍。因此，强烈建议考虑用于哑铃矢量设计的内含子和SV40增强子。这种先进的设计可以促进哑铃型DNA载体的临床前和临床应用。
【背景】虽然许多基因已经使用哑铃形DNA载体表达，但大多数这些应用使用包括启动子，编码序列（CDS）和转录终止子的基本设计。一些载体包括嵌合内含子，然而，没有报道通过这种设计增强了转基因表达（Schirmbeck等人，2001）。在这里，我们研究了分子特征引发的效应，这些特征经常在哑铃驱动基因表达的质粒设计中得到应用：1.已知来自人β-珠蛋白基因剪接的嵌合内含子促进RNA加工，核出口，随后基因表达（Luo ...
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| Microglial Phagocytosis Assay
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] Phagocytosis is essential for microglial clearance of apoptotic cells, extracellular protein aggregates, and infectious bacteria in the central nervous system (CNS). While the preparation of primary microglial culture has been described elsewhere, this protocol describes the microglial phagocytosis experimental procedure and the subsequent measurement of microglial phagocytic ability using fluorescent latex beads or fluorescent amyloid beta 42 (Aβ42) peptides.
[摘要] 吞噬作用对于中枢神经系统（CNS）中细胞凋亡细胞，细胞外蛋白质聚集体和感染性细菌的小胶质细胞清除至关重要。 虽然其他地方已经描述了原代小胶质细胞培养物的制备，但是该方案描述了小胶质细胞吞噬实验程序和随后使用荧光乳胶珠或荧光淀粉样蛋白β42（Aβ42）肽测量小胶质细胞吞噬能力。
【背景】小神经胶质细胞在中枢神经系统（CNS）中起多重作用。刺激后，小胶质细胞呈现复杂的炎症反应，包括改变的基因表达和形态变化（Heneka等，2014; Cunningham，2013）。细胞因子是通过活化的小胶质细胞改变的表达分子列表中的关键的蛋白质簇。通过在星形胶质细胞，神经元和其他脑细胞类型上表达的有效的信号传导能力的细胞因子受体，小胶质细胞传达，募集和协调炎性事件（Smith等，2012）。除了细胞因子分泌，吞噬细胞，其涉及小胶质细胞的形态学变化，也增加了他们作为CNS环境中环境稳态监护人的作用。病原体的小胶质细胞吞噬作用，细胞外蛋白质聚集体和凋亡细胞碎片抑制炎症和保护神经元（Fu et al。，2014）。除致病条件外，小神经胶质细胞吞噬也通过消除非功能性突触参与CNS发育和突触发生。缺乏或过量的小神经胶质细胞吞噬能力可导致突触连接异常和聚集蛋白沉积（Schafer et al。，2012; Lian et ...
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| Protocol for Primary Microglial Culture Preparation
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] Primary microglia, in either mono-culture or co-culture with neurons or astrocytes, are a powerful tool for studying mechanisms underlying microglial inflammatory responses and cell type-specific interactions in the central nervous system (CNS). This protocol provides the details of how to prepare high purity primary microglia from newborn mouse pups. The overall steps include brain cell dissociation, mixed glial cell culture, and microglia isolation.
[摘要] 单细胞培养或与神经元或星形胶质细胞共培养的原代小胶质细胞是研究中枢神经系统（CNS）中小胶质细胞炎症反应和细胞类型特异性相互作用的机制的有力工具。 该方案提供了如何从新生小鼠幼崽准备高纯度小胶质细胞的细节。 总体步骤包括脑细胞解离，混合胶质细胞培养和小胶质细胞分离。
【背景】近年来，神经炎症已成为神经科学研究的热点领域。在各种神经系统疾病患者的脑中观察到炎症反应，如胶质细胞激活和细胞因子上调（Fan等，2015; Koshimori等，2015; Garden and Campbell，2016）。神经炎症不仅被认为是脑内病理变化的结果，而且也是疾病进展的贡献者（Schwartz等，2013）。此外，炎症途径的生理功能，其重要性以前被低估，正在被揭示为令人惊讶的多才多艺。例如，补体信号通路的激活通常在神经系统疾病中的中枢神经系统（CNS）中被观察到，并被怀疑参与疾病病理生理学（Michailidou等人，2015; Loeffler等人，2008）。现在我们知道它也在突触细化发育调控中发挥重要作用（Stevens et ...
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