| Snapshots of the Signaling Complex DesK:DesR in Different Functional States Using Rational Mutagenesis and X-ray Crystallography
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] We have developed protocols to generate site-specific variants of the histidine-kinase DesK and its cognate response regulator DesR, conducive to trapping different signaling states of the proteins. Co-expression of both partners in E. coli, ensuring an excess of the regulator, was essential for soluble production of the DesK:DesR complexes and further purification. The 3D structures of the complex trapped in the phosphotransferase and in the phosphatase reaction steps, were solved by X-ray crystallography using molecular replacement. The solution was not trivial, and we found that in ...
[摘要] 我们已经开发了产生组氨酸激酶DesK及其同源反应调节物DesR的位点特异性变体的方案，有助于捕获蛋白质的不同信号状态。两个合作伙伴在大肠杆菌中的共表达，确保调节剂过量，对于DesK：DesR复合物的可溶性生产和进一步纯化是至关重要的。通过使用分子置换的X射线晶体学解决了捕获在磷酸转移酶和磷酸酶反应步骤中的复合物的3D结构。该解决方案不是微不足道的，我们发现在用作搜索探针的硅片生成的模型中，有助于将大部分复合物放置在不对称单元中。电子密度图就足够清楚了，可以进行人工建模，获得完整的原子模型。这些方法有助于解决细菌信号领域的主要挑战，即获得稳定的激酶：调节复合物，具有不同的构象状态，适用于高分辨率晶体学研究。
【背景】关于细菌信号复合物，特别是双组分系统（TCS）的结构信息仍然很少（Casino et al。，2009; Gao and Stock，2009）。 TCS包含几乎所有细菌中的感觉组氨酸激酶（HK）和响应调节剂（RR）配偶体，它们允许细胞感知环境并通过适应性反应相应地反应。尽管在信号传输中这种切换机制的重要性（Trajtenberg等，2016），结构信息对于采用不同功能状态的TCS复合体甚至更为有限。我们研究了DesK-DesR途径（de Mendoza，2014），一种来自枯草芽孢杆菌的TCS，其参与调节细胞膜组成以适应降低双层流动性的线索，如冷休克。 ...
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| Heterologous Expression and Purification of the Magnesium Transporter A (MgtA) in Escherichia coli
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Author:
Date:
2016-11-20
[Abstract] The magnesium transporter A (MgtA) is a magnesium transporting P-type ATPase present in prokaryotes and plants (Subramani et al., 2016). In Salmonella typhimurium and Escherichia coli (E. coli), MgtA is expressed only in magnesium limiting conditions and plays an important role in Mg2+ homeostasis (Groisman et al., 2013). The transcription of mgtA is regulated by the two-component system PhoP/PhoQ (Soncini et al., 1996; Kato et al., 1999). The membrane bound histidine kinase, PhoQ, senses low Mg2+ ...
[摘要] 镁转运蛋白A（MgtA）是存在于原核生物和植物中的镁转运P型ATP酶（Subramani等，2016）。在鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌（Escherichia coli）（大肠杆菌）中，MgtA仅在镁限制条件下表达，并在Mg2 +稳态中起重要作用（Groisman等，2013）。 mgtA的转录由双组分系统PhoP / PhoQ（Soncini等人，1996; Kato等，1999）调节。膜结合的组氨酸激酶PhoQ感测周质空间中的低Mg2 +浓度，并磷酸化其启动mgtA转录的同源反应调节因子PhoP（Groisman等，2013）。通过将Mg2 +导入细胞质，MgtA靶向质膜并促进低Mg2 +条件下的细菌存活。矮牵牛的MgtA同源物（PH1）在液泡膜中发现，涉及花瓣的着色（Faraco等，2014）。作为理解MgtA Mg2 +转运的分子细节的第一步，我们描述了可用于生物化学和生物物理学研究的大肠杆菌MgtA的纯化的详细方案。在大肠杆菌DH5α中克隆了在N末端具有六氨基组氨酸标签的重组大肠杆菌MgtA，并在大肠杆菌C43（DE3）中通过发酵至OD> 6进行表达。细胞裂解在高压均化器并通过超速离心分离膜。用洗涤剂十二烷基-β-D麦芽糖苷溶解膜蛋白质。通过亲和力和尺寸排阻色谱纯化MgtA。纯化的MgtA的最终产量每3g湿细胞沉淀达到〜1mg MgtA。
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