| Relative Quantification of NaV1.1 Protein in Mouse Brains Using a Meso Scale Discovery-Electrochemiluminescence (MSD-ECL) Method
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Densitometric analysis is often used to quantify NaV1.1 protein on immunoblots, although the sensitivity and dilution linearity of the method are usually poor. Here we present a protocol for quantification of NaV1.1 in mouse brain tissues using a Meso Scale Discovery-Electrochemiluminescence (MSD-ECL) method. MSD-ECL is based on ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) and uses electrochemiluminescence to produce measurable signals. Two different antibodies are used in this assay to capture and detect NaV1.1 respectively in brain tissue lysate. The specificity of the antibodies is confirmed ...
[摘要] [摘要]尽管该方法的灵敏度和稀释度线性通常较差，但经常使用光密度分析法定量免疫印迹上的Na V 1.1蛋白。这里瓦特E存在的Na进行定量的协议V在使用小鼠脑组织1.1细观量表发现-电化学发光（MSD-ECL）方法。MSD-ECL基于ELISA（酶联免疫吸附测定），并使用电化学发光产生可测量的信号。此测定法中使用了两种不同的抗体来捕获和检测Na V 1.1分别在脑组织中溶解。Scn1a基因敲除组织证实了抗体的特异性。此测定法中使用的校准曲线标准品是用掺有小鼠脑裂解液的小鼠肝裂解液而不是重组蛋白生成的。我们证明该方法是合格的，可用于特异性，准确度和精密度定量的小鼠脑组织中的Na V 1.1 。
[背景]的Na V 1.1，也称为电压门控钠通道的α亚基，I型，是一种跨膜通过对编码蛋白SCN1A基因（Meisler等人，2010 ）。功能性Na V 1.1的表达降低会导致Dravet综合征（DS），这是一种严重的早发性癫痫性脑病（Dravet等，2005）。Na V 1.1在生物样品中的表达已用作DS的非临床药理生物标记物，可以使用免疫印迹的光密度分析进行测量。密度测定法通常不如标准免疫测定法准确和灵敏。此外，由于蛋白质序列的同源性，某些Na V 1.1抗体可能会与其他电压门控钠通道（VGSC）发生交叉反应，包括Na V 1.2，Na V 1.3和Na ...
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| Biochemical Analysis of Dimethyl Suberimidate-crosslinked Yeast Nucleosomes
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Nucleosomes are the fundamental unit of eukaryotic chromosome packaging, comprised of 147 bp of DNA wrapped around two molecules of each of the core histone proteins H2A, H2B, H3, and H4. Nucleosomes are symmetrical, with one axis of symmetry centered on the homodimeric interaction between the C-termini of the H3 molecules. To explore the functional consequences of nucleosome symmetry, we designed an obligate pair of H3 heterodimers, termed H3X and H3Y, allowing us to compare cells with single or double H3 alterations. Our biochemical validation of the heterodimeric X-Y interaction included ...
[摘要] 核小体是真核染色体包装的基本单元，由围绕核心组蛋白H2A，H2B，H3和H4中的每一个的两个分子包裹的147bp DNA组成。 核小体是对称的，一个对称轴以H3分子的C-末端之间的同源二聚体相互作用为中心。 为了探索核小体对称性的功能性后果，我们设计了一对特异性H3异二聚体，称为H3X和H3Y，使我们能够比较具有单一或双重H3改变的细胞。 我们对异二聚体X-Y相互作用的生物化学验证包括使用二甲基琥珀三酸酯（DMS）进行的核内H3交联。 在这里，我们提供了使用DMS来分析酵母核小体的详细方案。
【背景】组蛋白的翻译后修饰影响染色体生物学的各个方面，包括转录，复制，修复和重组。因为核小体包含每个核心组蛋白的两个拷贝，所以修饰可以是对称的（在两个H3尾部上的相同修饰，例如，在核小体内的两个H3尾部上的K27me（Voigt等人
对于单个核小体内H3X-H3Y相互作用的生化验证，我们生成了表达细菌生物素连接酶BirA，N-末端V5-标记的H3X和N-末端生物素接受表位标记的H3Y的酵母菌株（Beckett等人， 1999）。 ...
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| MPM-2 Mediated Immunoprecipitation of Proteins Undergoing Proline-directed Phosphorylation
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Immunoprecipitation (IP) represents a widely utilized biochemical method to isolate a specific protein from a complex mixture taking advantage of an antibody that specifically recognizes that particular target molecule. This procedure is extremely versatile and can be applied to concentrate a specific protein, to identify interacting partners in complex with it or to detect post-translational modifications. The mitotic protein monoclonal 2 (MPM-2) is an antibody originally raised against extracts of synchronized mitotic HeLa cells to identify proteins selectively present in mitotic, and not ...
[摘要] 免疫沉淀（IP）代表广泛使用的生物化学方法，以利用特异性识别特定靶分子的抗体从复杂混合物中分离特异性蛋白质。该程序是非常通用的，可以应用于集中特定蛋白质，识别与其复合的相互作用的配偶体或检测翻译后修饰。有丝分裂蛋白单克隆2（MPM-2）是最初针对同步有丝分裂HeLa细胞的提取物产生的抗体，以鉴定选择性存在于有丝分裂中的蛋白质，而不是在间期细胞中（Davis等，1983）。 MPM-2识别磷酸化的丝氨酸或苏氨酸残基，随后是脯氨酸（pS / T-P），由脯氨酸指导的蛋白激酶和磷酸酶的共同作用产生的共有表位（Lu等，2002）。这些可逆磷酸化事件已经出现以通过促进目标上的构象变化来控制各种细胞过程，这不仅仅是由于磷酸化事件本身。这些基序一旦被磷酸化，就能够招募Pin1（肽基 - 脯氨酰异构酶NIMA相互作用蛋白1）（Lu等人，1996; Lu和Zhou，2007），这是一个促进肽键上的顺式/反式异构化反应的伴侣，在基础功能不同的构象之间切换底层（Lu，2004; Wulf等人，2005）。该方案描述了使用支架分子突触后密度蛋白-95（PSD-95）（Chen等人，2005），神经元Pin1靶（Antonelli等，2016）作为示例的基于MPM-2的免疫沉淀策略以说明详细的程序。
【背景】由MPM-2抗体识别的抗原的鉴定代表了发现经过磷酸化脯氨酰异构化调控机制的靶分子的有用起点。 ...
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