| High-level Production of Recombinant Membrane Proteins Using the Engineered Escherichia coli Strains SuptoxD and SuptoxR
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] We have previously described the development of two specialized Escherichia coli strains for high-level recombinant membrane protein (MP) production. These engineered strains, termed SuptoxD and SuptoxR, are capable of suppressing the cytotoxicity caused by MP overexpression and of producing greatly enhanced MP yields. Here, we present a Bio-protocol that describes gene overexpression and culturing conditions that maximize the accumulation of membrane-integrated and well-folded recombinant MPs in these strains.
[摘要] [摘要] 我们之前已经描述了两种用于生产高水平重组膜蛋白（MP）的大肠杆菌菌株的开发。这些工程菌株，称为SuptoxD和SuptoxR，能够抑制MP过度表达引起的细胞毒性，并产生显著提高的MP产量。在这里，我们提出一个生物协议，描述基因过度表达和培养条件，最大限度地积累膜整合和折叠良好的重组多磺酸粘多糖在这些菌株。
[背景]多磺酸粘多糖在所有活生物体的细胞中执行多种关键功能（Wagner et al.，2006；Schlegel et al.，2010），是当前和未来药物的主要靶点（Yildrim et al.，2007）。获得足够数量的分离蛋白是进行生化和结构研究的前提，这反过来又可以加深对其功能的理解，并发现新的MP靶向药物。
由于多磺酸粘多糖通常在其天然环境中以极低的丰度出现，异源宿主通常用于其重组过表达和随后的纯化。许多不同的系统已被用作原核和真核来源的多种多磺酸粘多糖的过表达宿主（Wagner等人，2006年）。其中，大肠杆菌是最受欢迎的一种，因为它的成本非常低，使用方便（Makino等人，2011年）。事实上，这种细菌已经成功地用于生产储存在蛋白质数据库中的所有重组产生的MP结构的大约20%（Dilworth等人，2018年）。尽管有这些优势和成功，但使用大肠杆菌作为MP生产的异源宿主通常伴随着严重的毒性、低水平的最终生物量和微小的最终产量（Miroux和Walker，1996；Wagner等人，2007；Link等人，2008；Gubellini等人，2011）。 ...
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| Cell-to-cell DNA Transfer among Thermus Species
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Author:
Date:
2016-11-20
[Abstract] The ability to transfer DNA via direct cell-to-cell contact-dependent process similar to conjugation has been described in Thermus thermophilus (Tth). Here, we detail the mating experiment protocol involving the lateral transfer of thermostable antibiotic resistance markers (i.e., kanamycin: KmR; hygromycin: HygR) between Thermus cells, enabling the selection and quantification of the transfer frequencies. Briefly, liquid cultures of both mates are mixed and laid onto a nitrocellulose filter on a TB plate. After incubation at 60 °C, filters are ...
[摘要] 通过与共轭相似的直接细胞间接触依赖性过程转移DNA的能力已在Thermus thermophilus（Tth）中描述。在这里，我们详细描述了包括热稳定抗生素抗性标记（即卡那霉素：Km），潮霉素：Hyg R 的横向转移的交配实验方案>）在 细胞之间，使得能够选择和量化转移频率。简言之，将两种配合物的液体培养物混合并铺在TB板上的硝酸纤维素滤膜上。在60℃温育后，在选择性平板培养基上重悬浮过滤器。通过向混合物中加入DNA酶I消除通过转化的DNA摄取的贡献。该方案可用于将大DNA片段（> 10kb）转移到Thermus 物种。
[背景] 是大多数细菌水平基因转移的主要机制，是一种高度专业化的过程，通过其DNA在直接接触的两个细胞之间转移（Lederberg和Tatum，1946）。经典缀合涉及DNA分子（通常是质粒编码的）从供体到受体细胞的单向转移，其仍然是被动的。然而，已经描述了用于多种细菌的替代模型。在实验室中，缀合实验对于标志物交换诱变是有效的。在其它遗传转移方法中，缀合在细菌包膜的最小破坏和转移大DNA片段（包括大的染色体区域（> 10kb））的可行性方面是有利的。 在T之间的共轭样过程。嗜热细菌在十年前被报道，其中染色体标记在重组HFR - ...
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| Transformation of Thermus Species by Natural Competence
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Date:
2016-11-20
[Abstract] Many Thermus species harbour genomes scourged with horizontally transferred signatures. Thermus thermophilus (Tth) has been characterized as naturally competent. The transformation protocol described here is based on the maximum DNA uptake rates registered at mid-exponential phase (OD600 0.3-0.4). Here we describe the stepwise protocol followed for transformation of both plasmids and linearized genomic DNA, of which the latter can be employed as an alternative method to electroporation to introduce mutations or to generate gene deletions in Thermus ...
[摘要] 许多 物种港口基因组受到水平转移的签名的影响。 嗜热栖热菌 （ Tth ）已被表征为天生胜任。本文所述的转化方案是基于在中指数期（OD <600> 0.3-0.4）处登记的最大DNA摄取速率。在这里我们描述了转化质粒和线性化基因组DNA的逐步方案，其中后者可以用作电穿孔以引入突变或在Thermus 分离物中产生基因缺失的替代方法，实例。 [背景] 嗜热栖热菌（ Tth ）是一种极端的嗜热菌种，由于其古老的系统发生起源，其蛋白质和大分子复合物的结晶的相对容易，以及其几种分离物的实验室生长条件下的快速生长和良好产量。在最常用的分离株中，菌株T。嗜热链球菌HB27和HB8构成最常用的模型，因为它们可以通过天然能力转化的高比率。任何来源和拓扑的DNA可以通过以约40kb/s /细胞的速率培养这些分离物的细胞容易地被吸收（Schwarzenlander和Averhoff，2006），显示约10个转化体/活细胞。为此，涉及在两种菌株的染色体（Averhoff，2009）中的五个基因座中编码的至少16种蛋白质的极性定位的天然竞争性装置（Gold等人，2015）基本上表达在组成型虽然转化效率在指数期较高。已经通过定向进化作为基因标记开发了编码热稳定变体的抗生素抗性基因的变体，以这种方式，可以在具有卡那霉素（Lasa等人，1992），潮霉素B ...
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