| Robust Generation of Knock-in Cell Lines Using CRISPR-Cas9 and rAAV-assisted Repair Template Delivery
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The programmable Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (Cas9) technology revolutionized genome editing by providing an efficient way to cut the genome at a desired location (Ledford, 2015). In mammalian cells, DNA lesions trigger the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism. However, in presence of a DNA repair template, Homology-Directed Repair (HDR) can occur leading to precise repair of the lesion site. This last process can be exploited to enable precise knock-in changes by introducing the desired genomic ...
[摘要] 可编程集群定期间隔短回归度（CRISPR）相关核酸酶9（Cas9）技术通过提供在所需位置切割基因组的有效方式，彻底改变了基因组编辑（Ledford，2015）。 在哺乳动物细胞中，DNA损伤触发易发生非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制。 然而，在DNA修复模板的存在下，可以发生同源性定向修复（HDR），导致病变部位的精确修复。 可以利用最后的方法，通过在修复模板上引入所需的基因组改变来实现精确的敲入变化。 在本协议中，我们描述了使用重组腺相关病毒（rAAV）在人细胞系中进行基于CRISPR-Cas9的C-末端标签序列敲入的长修复模板（> 200个核苷酸）的递送。
尽管有关CRISPR-Cas9产生的敲门模型系统的大量报告，敲门砖报告仍然落后。由于许多应用，产生敲入细胞系仍然是基因组编辑的明显目标。敲入改变的引入通常依赖于修复模板DNA的存在，并且在位点特异性双链（ds）DNA断裂被引入接近改变位点的基因组中后，HDR修复机制的激活。不同的模板可以传送到修复机器，范围从含有广泛同源区域和可选选择盒的经典线性化载体到约200个核苷酸的单链（ss）DNA寡核苷酸（Chen等人， ...
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| Cell-to-cell DNA Transfer among Thermus Species
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Author:
Date:
2016-11-20
[Abstract] The ability to transfer DNA via direct cell-to-cell contact-dependent process similar to conjugation has been described in Thermus thermophilus (Tth). Here, we detail the mating experiment protocol involving the lateral transfer of thermostable antibiotic resistance markers (i.e., kanamycin: KmR; hygromycin: HygR) between Thermus cells, enabling the selection and quantification of the transfer frequencies. Briefly, liquid cultures of both mates are mixed and laid onto a nitrocellulose filter on a TB plate. After incubation at 60 °C, filters are ...
[摘要] 通过与共轭相似的直接细胞间接触依赖性过程转移DNA的能力已在Thermus thermophilus（Tth）中描述。在这里，我们详细描述了包括热稳定抗生素抗性标记（即卡那霉素：Km），潮霉素：Hyg R 的横向转移的交配实验方案>）在 细胞之间，使得能够选择和量化转移频率。简言之，将两种配合物的液体培养物混合并铺在TB板上的硝酸纤维素滤膜上。在60℃温育后，在选择性平板培养基上重悬浮过滤器。通过向混合物中加入DNA酶I消除通过转化的DNA摄取的贡献。该方案可用于将大DNA片段（> 10kb）转移到Thermus 物种。
[背景] 是大多数细菌水平基因转移的主要机制，是一种高度专业化的过程，通过其DNA在直接接触的两个细胞之间转移（Lederberg和Tatum，1946）。经典缀合涉及DNA分子（通常是质粒编码的）从供体到受体细胞的单向转移，其仍然是被动的。然而，已经描述了用于多种细菌的替代模型。在实验室中，缀合实验对于标志物交换诱变是有效的。在其它遗传转移方法中，缀合在细菌包膜的最小破坏和转移大DNA片段（包括大的染色体区域（> 10kb））的可行性方面是有利的。 在T之间的共轭样过程。嗜热细菌在十年前被报道，其中染色体标记在重组HFR - ...
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