| Immunogold Electron Microscopy of the Autophagosome Marker LC3
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] Even though autophagy was firstly observed by transmission electron microscopy already in the 1950s (reviewed in Eskelinen et al., 2011), nowadays this technique remains one of the most powerful systems to monitor autophagic processes. The autophagosome, an LC3-positive double membrane structures enclosing cellular materials, represents the key organelle in autophagy and its simple visualization and/or numeration allow to draw important conclusions about the autophagic flux. Therefore, the accurate identification of autophagosomes is crucial for a comprehensive and detailed ...
[摘要] 尽管早在20世纪50年代就已经通过透射电子显微镜观察了自噬（在Eskelinen等人2011年的综述中），但是现在这种技术仍然是监测自噬过程的最强大的系统之一。 自噬体是包含细胞物质的LC3阳性双层膜结构，代表了自噬的关键细胞器，其简单的可视化和/或计数允许得出关于自噬流的重要结论。 因此，准确鉴定自噬体对自噬的全面和详细的分析至关重要。 在这里我们提出一个简单的协议，以确定autophagosomes透射电子显微镜耦合LC3的免疫金标记从一个相对较低的细胞数量，我们最近开发遵循病毒介导的人类癌变期间的自噬途径。
【背景】自噬体代表了macroautophagy的关键结构，这是一种细胞胞质成分的分解代谢系统。巨自噬（或简单地自吞噬）由吞噬细胞的形成引发，所述吞噬细胞能够自身扩张吞噬细胞器和蛋白质，所述蛋白质最终闭合在螯合成分周围形成被称为自噬体的细胞器。接下来，在成熟过程中，自噬体可以与溶酶体融合以形成自溶酶体，其中被捕获的物质被位于溶酶体限制性膜中的泵降解并再循环回（Glick et al。，2010）。
由于自噬功能障碍与各种人类疾病，病毒感染，神经退行性疾病，免疫功能和癌症有关（Schneider and ...
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| In situ Hybridization (ISH) and Quantum Dots (QD) of miRNAs
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Author:
Date:
2017-02-20
[Abstract] miRNA are short non-coding RNA which inhibit translation of mRNA. miRNA regulate several cellular processes. Certain miRNA are known to induce oncogenesis. miRNA can be measured by real-time PCR and be imaged using a combination of in situ hybridization (ISH) and quantum dots (QD). The advantage of using quantum dots is that several miRNA can be simultaneously measured using multiplexed QD. Additionally, miRNA can be visualized in different regions of the tissue. Since miRNA are biomarkers of various disease states, miRNA can be visualized and quantitated in tissue sections for ...
[摘要] miRNA是抑制mRNA翻译的短非编码RNA。 miRNA调节几种细胞过程。已知某些miRNA诱导肿瘤发生。 miRNA可以通过实时PCR测量，并使用原位杂交（ISH）和量子点（QD）的组合进行成像。使用量子点的优点是可以使用多重QD同时测量几种miRNA。此外，miRNA可以在组织的不同区域可视化。由于miRNA是各种疾病状态的生物标志物，miRNA可以在组织切片中进行可视化和定量，以用于诊断和预后。这里我们描述组织切片的ISH-QD分析。使用来自异种移植物或临床标本的组织切片。将其脱石蜡，用蛋白酶K处理并与生物素探针杂交以对miRNA具有特异性。原位杂交通过标记生物素探针进行，然后用链霉亲和素标记的量子点进行标记。进行量子点的图像采集并分析其miRNA表达水平。结合ISH和QD为检测组织不同细胞中的miRNA提供了强大的工具。
背景 ...
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| Isolation of THY1+ Undifferentiated Spermatogonia from Mouse Postnatal Testes Using Magnetic-activated Cell Sorting (MACS)
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] In mammals, homeostasis of many tissues rely on a subpopulation of cells, referred to as stem cells, to sustain an appropriate number of undifferentiated and differentiated cells. Spermatogonial stem cells (SSCs) provide the fundamental cellular source for spermatogenesis and are responsible for the lifelong maintenance of the germline pool in testes throughout the reproductive lifespan of males. To gain insight into germline stem cell biology and develop strategies for infertility treatment, several germ cell isolation methods have been reported in order to acquire good quality and quantity ...
[摘要] 在哺乳动物中，许多组织的体内平衡依赖于称为干细胞的细胞亚群，以维持适量的未分化细胞和分化细胞。精原细胞干细胞（SSC）为精子发生提供了基本的细胞来源，并且负责终生维持雄性生殖期间睾丸中的种系池。为了获得对种系干细胞生物学的了解并制定不孕症治疗策略，已经报道了几种生殖细胞分离方法，以获得良好质量和数量的未分化精原细胞。其中，磁激活细胞分选（MACS）是一种有效的细胞分离方法，其需要较少的时间和较少的初始细胞数以使用抗原 - 抗体反应来获得富集的细胞群体。胸腺细胞抗原1（THY1，CD90.2）被认为是小鼠新生儿和成年睾丸中未分化精原细胞的表面标志物。在这里，我们描述了一个用于分离来自小鼠睾丸的一周龄THY1 + 细胞和四周龄THY1 + 细胞的方案。分离过程包括三个步骤：睾丸收集和单细胞悬浮，使用生物素缀合的抗THY1抗体的细胞标记和磁性细胞分离。注意，这种隔离方案应在五小时内完成，以最大限度地提高活细胞的质量和数量。
背景 在几个成人组织中观察到活性和静止干细胞的共存。静止，自我更新和分化之间的充分平衡对于维持适当数量的未分化干细胞是必要的，并且避免过早的干细胞耗尽许多组织的体内平衡（Tseng等人，2015; Wabik和Jones，2015; ...
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