| Expression and Purification of Mini G Proteins from Escherichia coli
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Heterotrimeric G proteins modulate intracellular signalling by transducing information from cell surface G protein-coupled receptors (GPCRs) to cytoplasmic effector proteins. Structural and functional characterisation of GPCR–G protein complexes is important to fully decipher the mechanism of signal transduction. However, native G proteins are unstable and conformationally dynamic when coupled to a receptor. We therefore developed an engineered minimal G protein, mini-Gs, which formed a stable complex with GPCRs, and facilitated the crystallisation and structure determination of ...
[摘要] 异源三聚体G蛋白通过将细胞表面G蛋白偶联受体（GPCR）的信息转导至细胞质效应蛋白来调节细胞内信号传导。 GPCR-G蛋白复合物的结构和功能表征对于完全破译信号转导机制是重要的。然而，当与受体偶联时，天然G蛋白质是不稳定的并具有构象的动力学。因此，我们开发了一种工程化的最小G蛋白，其与GPCR形成稳定的复合物，促进了人腺苷A 2A受体的结晶和结构测定（A 2AR）的活性构象。 Mini G蛋白是各种应用中潜在有用的工具，包括表征GPCR药理学，结合亲和力和动力学实验，激动剂药物发现和GPCR-G蛋白复合物的结构测定。在这里，我们描述了一个用于表达和纯化mini-G 的详细方案。
我们最近报告了一种工程化的最小G蛋白质（Carpenter和Tate，2016）的开发，其促进了人腺苷A 2A受体的结晶（ A 2 R 2）其活性构象（Carpenter等人，2016; Carpenter和Tate，2017）。不同于需要在真核系统中表达的异源三聚体G蛋白质，在大肠杆菌（大肠杆菌）中高度表达微型G蛋白，并且可以可以容易地纯化，每升培养物的产量为50-100mg的mini-G 。在这里，我们描述了早先在Carpenter和Tate（2016）中描述的可以用于前面描述的任何一种迷你G蛋白构建体的表达和纯化的逐步方案（Carpenter等人， ...
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| In vitro Autophosphorylation and Phosphotransfer Assay of Cyanobacterial Histidine Kinase 2
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Date:
2016-12-05
[Abstract] This is a detailed protocol of an autophosphorylation and phosphotransfer activities of Synechocystis sp. PCC 6803 full-length Histidine Kinase 2 (Hik2) protein described by Ibrahim et al., 2016. In this protocol, radioactively labelled ATP was used to study an autophosphorylation and phosphotransfer activity of the full-length Hik2 protein.
[摘要] 这是集胞藻的自磷酸化和磷酸转移活性的详细方案。在该方案中，使用放射性标记的ATP来研究全长Hik2的自磷酸化和磷酸转移活性，所述磷酸转移活性是由Ibrahim等人在2016年描述的。蛋白。
关键字：组氨酸激酶2，自身磷酸化，磷酸转移，Rre1，RppA，集胞藻。 PCC 6803
[背景] 蛋白磷酸化是发生在每个活生物体中的蛋白质的重要翻译后修饰。蛋白激酶（催化蛋白质磷酸化的酶）的活性首先由Burnett和Kennedy在1954年描述，其中它们通过肝酶显示酪蛋白的磷酸化（Burnett和Kennedy，1954）。然而，它的意义直到20世纪70年代和80年代才被欣赏（Cohen，2002）。可以使用偶联测定或直接用放射性标记的ATP研究磷酸γ-磷酸从ATP分子转移到蛋白质。基于掺入32 ...
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