| A Quantitative Heterokaryon Assay to Measure the Nucleocytoplasmic Shuttling of Proteins
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Many proteins appear exclusively nuclear at steady-state but in fact shuttle continuously back and forth between the nucleus and the cytoplasm. For example, nuclear RNA-binding proteins (RBPs) often accompany mRNAs to the cytoplasm, where they can regulate subcellular localization, translation and/or decay of their cargos before shuttling back to the nucleus. Nucleocytoplasmic shuttling must be tightly regulated, as mislocalization of several RBPs with prion-like domains such as FUS and TDP-43 causes the cytoplasmic accumulation of solid pathological aggregates that have been implicated in ...
[摘要] 许多蛋白质在稳态下仅出现核，但事实上在细胞核和细胞质之间连续地来回穿梭。例如，核RNA结合蛋白（RBP）通常伴随mRNA到达细胞质，在那里它们可以在穿梭回到细胞核之前调节其货物的亚细胞定位，翻译和/或腐烂。必须严格调节核质穿梭，因为几种RBP与朊病毒样结构域如FUS和TDP-43的错误定位导致固体病理性聚集体的细胞质积累，这些聚集体与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆等神经退行性疾病有关。 （FTD）。传统上，种间异核体分析已被用于确定感兴趣的核蛋白是否穿梭;这些分析是基于来自两个不同物种（例如，小鼠和人类）的供体和受体细胞之间的融合，可以根据不同的染色质染色模式区分，并检测蛋白质的外观。受体核。然而，异核体的鉴定需要经验并且容易出错，这使得难以获得用于定量研究的高质量数据。此外，荧光标记的RBP在供体细胞中的瞬时过表达通常导致其异常的亚细胞定位。在这里，我们提出定量测定，其中表达接近生理水平的eGFP标记的RBP的稳定供体细胞系与表达膜标记物CAAX-mCherry的受体细胞融合，允许容易地鉴定和成像大量高可信度异核体。我们的测定法可用于测量任何感兴趣的核蛋白在不同细胞类型，不同细胞条件下或突变蛋白之间的穿梭活性。
【背景】要了解蛋白质的各种功能，重要的是找出它在细胞内定位的位置。标准的微观和生物化学方法仅在其稳态浓度高于检测阈值时才揭示蛋白质的存在。他们不排除它在短暂地定位的情况下扮演其他重要角色的可能性（Gama-Carvalho和Carmo-Fonseca，2001）。例如，许多RBP在不同的细胞区室中发挥作用，它们伴随着它们的结合mRNA（通常未检测到）并连接真核基因表达的多个步骤（Müller-McNicoll和Neugebauer，2013）。 ...
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| Ex vivo Culture of Adult Mouse Antral Glands
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Author:
Date:
2017-01-05
[Abstract] The tri-dimensional culture, initially described by Sato et al. (2009) in order to isolate and characterize epithelial stem cells of the adult small intestine, has been subsequently adapted to many different organs. One of the first examples was the isolation and culture of antral stem cells by Barker et al. (2010), who efficiently generated organoids that recapitulate the mature pyloric epithelium in vitro. This ex vivo approach is suitable and promising to study gastric function in homeostasis as well as in disease. We have adapted Barker’s protocol to ...
[摘要] 为了分离和表征成年小肠的上皮干细胞，最初由Sato等人（2009）描述的三维培养物已经随后适应于许多不同的器官。其中一个例子是Barker等人（2010）分离和培养窦性干细胞，他们有效地产生了在体外重现成熟幽门上皮的组织细胞。这种“离体”方法是适合的，并且有希望研究体内平衡和疾病中的胃功能。我们已经调整了Barker的方案来比较稳态和再生组织，这里，我们一步一步地仔细地描述了窦腺的分离和培养，以及从细胞分选后可能用于培养的窦腺中分离单细胞一个例子（Fernandez Vallone等人，2016）。
背景来自腺体的小鼠成体干细胞可以在3D matrigel中离体生长，作为“迷你腺体”无限期（Barker等人，2010） 。与EGF，Noggin和R-spondin 1存在下生长的小鼠成年小肠的干细胞相比，胃干细胞需要进一步补充Fgf10，胃泌素，Wnt3a和更高浓度的R-螺旋菌素1（称为作为ENRFGW）获得生产性文化。直到最近，在干细胞消融后，在离体培养系统中成体再生窦腺是否生长，如果是这样，仍然是未知的。使用本方案，证明了内源性和再生的腺体在接种时不会类似地生长并且表现出不同的生长培养要求。
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| Ex vivo Culture of Fetal Mouse Gastric Epithelial Progenitors
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Author:
Date:
2017-01-05
[Abstract] Isolation and tridimensional culture of murine fetal progenitors from the digestive tract represents a new approach to study the nature and the biological characteristics of these epithelial cells that are present before the onset of the cytodifferentiation process during development. In 2013, Mustata et al. described the isolation of intestinal fetal progenitors growing as spheroids in the ex vivo culture system initially implemented by Sato et al. (2009) to grow adult intestinal stem cells. Noteworthy, fetal-derived spheroids have high self-renewal capacity making ...
[摘要] 来自消化道的鼠胎儿祖细胞的分离和三维培养代表了研究在发育过程中细胞分化过程开始前存在的这些上皮细胞的性质和生物学特征的新方法。在2013年，Mustata等人描述了在最初由佐藤等人实施的离体培养系统中分离作为球体生长的肠胎细胞祖细胞。 >（2009）增长成年肠干细胞。值得注意的是，胎儿衍生的球体具有较高的自我更新能力，使其在文化中的无限期维护变得容易。在这里，我们报告了用于分离和远离前胃腺胃生长为胃球体的胎儿上皮祖细胞的分离和离体培养和维持的修改方案（Fernandez Vallone等人， 2016）。
背景 来自腺体的小鼠成体干细胞可以在3D matrigel中离体生长，作为“迷你腺体”无限期（Barker等人，2010） 。与在EGF，Noggin和R-spondin 1存在下生长的小肠的干细胞相比，成年胃干细胞需要进一步补充Fgf10，胃泌素，Wnt3a和更高浓度的R-spondin 1以获得生产性 - 文化。相比之下，到目前为止，很少知道在发育期间排列前腺上皮细胞的胎儿细胞。到目前为止，它们的性质以及其离体的潜在生长特性未明确。基于以前的研究，确定胎儿小肠（Mustata等人，2013年）中存在的细胞，我们报告了作为球体的小鼠胎儿胃祖细胞的培养（Fernandez Vallone et al。 。，2016）。可以在2009年由佐藤等人先前报道的培养基中重复胃祖细胞以生长小肠成体干细胞，与成人型胃干细胞相反，它们不需要额外的生长因子补充（Fgf10，Wnt3a或胃泌素）。 ...
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