| Chromatin Immunoprecipitation Experiments from Whole Drosophila Embryos or Larval Imaginal Discs
|
|
Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Chromatin Immunoprecipitation coupled either to qPCR (qChIP) or high-throughput sequencing (ChIP-Seq) has been extensively used in the last decades to identify the DNA binding sites of transcription factors or the localization of various histone marks along the genome. The ChIP experiment generally includes 7 steps: collection of biological samples (A), cross-linking proteins to DNA (B), chromatin isolation and fragmentation by sonication (C), sonication test (D), immunoprecipitation with antibodies against the protein or the histone mark of interest (E), DNA recovery (E), identification of ...
[摘要] 与qPCR（qChIP）或高通量测序（ChIP-Seq）相结合的染色质免疫沉淀已被广泛用于识别转录因子的DNA结合位点或基因组中各种组蛋白标记的定位。 ChIP实验通常包括7个步骤：收集生物样品（A），交联蛋白质到DNA（B），染色质分离和通过超声处理分离（C），超声处理测试（D），用针对蛋白质的抗体进行免疫沉淀感兴趣的组蛋白标记（E），DNA回收（E），通过PCR或测序鉴定因子相关DNA序列（F）。这里描述的协议可以容易地用于ChIP-seq和ChIP-qPCR实验。描述在完整的果蝇组织中优化分析的实验设置条件的整个过程可以在四天内完成。
背景 尽管永生化的培养细胞广泛用于研究各种细胞类型的染色质景观，但是在生理条件下在体内探测相互作用的有价值的方法对于进行转录的时间或空间比较分析是必要的因子和组蛋白修饰图在不同阶段的果蝇发展或不同组织之间。在这里，我们提供了一个详细的ChIP协议，已被优化，以便在整个果蝇胚胎和幼虫成像光盘上工作，突出关键的实验参数。
|
|
|
| Tandem Purification of His6-3x FLAG Tagged Proteins for Mass Spectrometry from Arabidopsis
|
|
Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Tandem affinity purification is a powerful method to identify protein complexes that function in association with a known gene of interest. This protocol describes a methodology to capture proteins tagged with His6-3x FLAG explicitly for the purpose of on-bead digestion and identification by mass spectrometry. The high sensitivity and specificity of our methods allow for purification of proteins expressed at native levels from endogenous promoters to enable uncovering the functional roles of plant protein complexes.
[摘要] 串联亲和纯化是识别与已知感兴趣基因相关联的蛋白质复合物的有力方法。 该方案描述了一种用于捕获用His6-3x FLAG标记的蛋白质的方法，用于通过质谱法进行珠粒消化和鉴定。 我们的方法的高灵敏度和特异性允许从内源启动子纯化以天然水平表达的蛋白质，以揭示植物蛋白复合物的功能作用。
【背景】蛋白质复合物作为信号平台，分子机器和构建细胞生命的支架。鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）或蛋白质复合物的组成对于提供对基因生物化学功能的了解是非常重要的。因此，需要了解发现PPI的简便方法，以了解基因型如何决定植物中的表型。
通常使用的蛋白质纯化方法包括色谱法，例如大小排阻色谱法（也称为凝胶过滤），离子交换层析和亲和层析。通常需要组合几种不同的色谱方法以达到足够的纯度以鉴定相关的复合物。最近，亲和纯化与质谱联用（AP-MS）已经成为系统地鉴定体内蛋白质 - ...
|
|
|
| Identification of Factors in Regulating a Protein Ubiquitination by Immunoprecipitation: a Case Study of TRF2 on Human REST4 Ubiquitination
|
|
Author:
Date:
2015-07-05
[Abstract] Ubiquitination is the first step of the ubiquitin-proteasome pathway that regulates cells for their homeostatic functions and is an enzymatic, protein post-translational modification process in which ubiquitin is transferred to a target protein substrate by a set of three ubiquitin enzymes (Weissman et al., 2011; Bhattacharyya et al., 2014; Ristic et al., 2014). Given the importance of this process, it is plausible that ubiquitination is under strict control by many factors and that the regulatory machineries are protein-specific. An assay for the detection of a ...
[摘要] 泛素化是泛素 - 蛋白酶体通路的第一步，其调节细胞的内环境稳定功能，并且是酶，蛋白质翻译后修饰过程，其中通过一组三种泛素酶将泛素转移到靶蛋白质底物（Weissman et al。，2011; Bhattacharyya et al。，2014; Ristic 等人，2014）。考虑到这一过程的重要性，似乎可能的是，泛素化受到许多因素的严格控制，并且调节机制是蛋白质特异性的。用于检测特异性蛋白泛素化的测定将使我们能够检查因子是否具有调节该蛋白的泛素化的功能。在这里我们描述一个协议，检测人类REST4蛋白在培养细胞中的神经选择性剪接异构体（RE-1沉默转录因子），拮抗REST对神经分化和神经元形成的镇压功能的泛素化状态。使用这个协议，我们显示端粒结合蛋白TRF2通过抑制其泛素化稳定人类REST4的表达。这表明TRF2在神经分化中发挥阳性作用（Ovando-Roche等人，2014）。该方案还可用于检测其他感兴趣的蛋白质的泛素化。
|
|
|