| Quantification of Membrane Damage/Cell Death Using Evan’s Blue Staining Technique
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Membrane damage is a hallmark of both biotic and abiotic stress responses. The membrane determines the ability of a cell to sustain altered environmental conditions and hence can be used as a biomarker to assess stress-induced cell damage or death. We present an easy, quick, cost-effective, staining and spectrophotometric method to assess membrane stability of plant cells. In this method, Evan’s blue, an azo dye, is used to assay for cell viability. More specifically, Evan’s blue dye can penetrate through ruptured or destabilized membranes and stain cells. Thus, when plant cells are subjected ...
[摘要] 膜损伤是生物和非生物胁迫反应的标志。膜决定细胞维持改变的环境条件的能力，因此可以用作生物标志物来评估应激诱导的细胞损伤或死亡。我们提出了一种简单，快速，经济有效的染色和分光光度法来评估植物细胞的膜稳定性。在这种方法中，Evan的蓝色偶氮染料被用于测定细胞活力。更具体地说，Evan的蓝色染料可以穿透破裂或不稳定的膜并染色细胞。因此，当植物细胞受到影响膜完整性的应激时，与不受应激的对照细胞相比，Evan蓝染料渗透的细胞数将增加。相比之下，能够保持膜完整性的活的健康细胞不会吸收Evan的蓝色染料。摄取Evan蓝色染料的细胞会积累蓝色原生质染料，这些染色的细胞可以在有或没有使用相机的明视野显微镜下进行定性记录。此外，染料可以从被Evan的蓝色染料染色的细胞中提取，并且可以通过分光光度法进行定量。使用这种分析，染色阳性染色细胞中染料的积累与细胞膜损伤的程度相关，因此在各种条件下用Evan蓝色染料染色的细胞数量可用作细胞应激的指标。
【背景】植物是暴露于各种紧张因素的固着生物。膜由脂质和糖蛋白组成，作为物理保护屏障。当细胞暴露于诸如热的应力时，细胞膜的流动性被改变。氧化应激会破坏细胞膜。与氧化应激相关的活性氧（ROS）可以作用于膜脂质以降低膜的稳定性。评估膜稳定性的一个已建立的方案，称为沙利文方法，量化了膜中电解质渗漏的程度（Sullivan和Ross，1979）。这种方法是耗时的，繁琐的，涉及几个步骤。另外，由于该方法通常需要将组织暴露于高温（初始电解质泄漏和在高温沸腾后的最终电解质泄漏），所以该方法不能用于评估暴露于应力的植物中对膜的瞬时损伤。我们调整了一种可靠的Evan蓝染色技术，被许多研究人员用于评估细胞死亡或膜损伤（Smith等，1982; ...
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| Advanced Design of Minimalistic Dumbbell-shaped Gene Expression Vectors
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Minimal DNA vectors exclusively comprising therapeutically relevant sequences hold great promise for the development of novel therapeutic regimen. Dumbbell-shaped vectors represent non-viral non-integrating DNA minimal vectors which have entered an advanced stage of clinical development (Hardee et al., 2017). Spliceable introns and DNA nuclear import signals such as SV40 enhancer sequences are molecular features that have found multiple applications in plasmid vectors to improve transgene expression. In dumbbells however, effects triggered by introns were not investigated and ...
[摘要] 唯一包含治疗相关序列的最小DNA载体对于新型治疗方案的发展具有很大的希望。哑铃型载体代表已经进入临床发展的晚期阶段的非病毒非整合DNA最小载体（Hardee等人，2017）。可接合的内含子和DNA核输入信号如SV40增强子序列是在质粒载体中发现多个应用以改善转基因表达的分子特征。然而，在哑铃中，由内含子引发的效应未被研究，基于DNA的核导入序列尚未发现应用，可能是因为哑铃载体在尺寸上不断被最小化。我们调查内含子和/或SV40增强子衍生序列对哑铃载体驱动的报告基因表达的影响。发现可拼接内含子的实现在所有研究的细胞系中无条件地增强基因表达。相反，SV40增强子的使用改善了细胞类型依赖性的基因表达。虽然这两个特征显着增加哑铃载体大小，但内含子和增强子或两者的组合都不会对基因表达产生负面影响。相反，与质粒或对照哑铃相比，这两个特征在一起改善了哑铃驱动的基因表达，高达160-或56倍。因此，强烈建议考虑用于哑铃矢量设计的内含子和SV40增强子。这种先进的设计可以促进哑铃型DNA载体的临床前和临床应用。
【背景】虽然许多基因已经使用哑铃形DNA载体表达，但大多数这些应用使用包括启动子，编码序列（CDS）和转录终止子的基本设计。一些载体包括嵌合内含子，然而，没有报道通过这种设计增强了转基因表达（Schirmbeck等人，2001）。在这里，我们研究了分子特征引发的效应，这些特征经常在哑铃驱动基因表达的质粒设计中得到应用：1.已知来自人β-珠蛋白基因剪接的嵌合内含子促进RNA加工，核出口，随后基因表达（Luo ...
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| Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Analysis of Plant Cell Wall Glycan Connections
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Author:
Date:
2014-04-20
[Abstract] Sandwich ELISA is a highly sensitive method that can be used to determine if two epitopes are part of the same macromolecule or supramolecular complex. In the case of plant cell wall glycans, it can reveal the existence of inter-polymers linkages, leading to better understanding of overall cell wall architectures. This development of a conventional sandwich ELISA protocol uses a carbohydrate-binding module (CBM), a small protein domain found in some carbohydrate catalysing or activating enzymes, and rat monoclonal antibodies (mAbs) which can be combined in the same ELISA plate without risk of ...
[摘要] 夹心ELISA是高度灵敏的方法，其可以用于确定两个表位是否是相同大分子或超分子复合物的一部分。 在植物细胞壁聚糖的情况下，它可以揭示存在的聚合物之间的联系，导致更好地了解整体细胞壁结构。 常规夹心ELISA方案的这种发展使用碳水化合物结合模块（CBM），在一些碳水化合物催化或活化酶中发现的小蛋白结构域和大鼠单克隆抗体（mAb），其可以组合在相同的ELISA板中，没有风险 交叉反应; 次级抗大鼠HRP抗体仅能够结合大鼠mAb，而不能结合CBM。 该协议在利兹大学的J. Paul Knox实验室开发和修改。
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