| Dual Fluorescence Reporter Based Analytical Flow Cytometry for miRNA Induced Regulation in Mammalian Cells
|
|
Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] MicroRNA-induced gene regulation is a growing field in basic and translational research. Examining this regulation directly in cells is necessary to validate high-throughput data originated from RNA sequencing technologies. For this several studies employ luciferase-based reporters that usually measure the whole cell population, which comes with low resolution for the complexity of the miRNA-induced regulation. Here, we provide a protocol using a dual-fluorescence reporter and flow cytometry reaching single cell resolution; the protocol contains a simplified workflow that includes: vector ...
[摘要] MicroRNA诱导的基因调控是基础和转化研究中不断增长的领域。 直接在细胞中检查该调节对于验证源自RNA测序技术的高通量数据是必要的。 对于这一研究，一些研究采用基于荧光素酶的报告基因，通常测量全细胞群，其具有低分辨率的miRNA诱导调节的复杂性。 在这里，我们提供使用双荧光报告基因和流式细胞仪达到单细胞分辨率的方案; 该协议包含一个简化的工作流程，包括：使用R环境进行矢量生成，数据采集，处理和分析。 我们的协议可实现miRNA诱导的转录后基因调控的高分辨率测量，并结合系统生物学，可用于估计miRNA的熟练程度。
【背景】MicroRNAs（miRNA）是高度保守的小型非蛋白质编码RNA（21-22nt），可调节转录后基因表达并调节基因生物学过程，如发育和细胞稳态（Lagos-Quintana et al。，2001; Fabian et al。，2010; Bartel，2018），包括miRNA表达与肿瘤进展和侵袭性相关的几种病理（Lu et al。， 2005; Di Leva和Croce，2013; Krishnan et al。，2015; Bertoli et ...
|
|
|
| Expansion of Airway Basal Cells and Generation of Polarized Epithelium
|
|
Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Airway basal stem cells are the progenitor cells within the airway that exhibit the capacity to self-renew and give rise to multiple types of differentiated airway epithelial cells. This stem cell-derived epithelium displays organized architecture with functional attributes of the airway mucosa. A protocol has been developed to culture and expand human airway basal stem cells while preserving their stem cell properties and capacity for subsequent mucociliary differentiation. This achievement presents a previously unrealized opportunity to maintain a durable supply of progenitor cells derived ...
[摘要] 气道基底干细胞是气道内的祖细胞，表现出自我更新的能力并产生多种类型的分化的气道上皮细胞。这种干细胞来源的上皮细胞显示出具有气道粘膜功能属性的有组织的结构。已经开发了一种方案来培养和扩展人气道基底干细胞，同时保持其干细胞特性和后续粘液分泌的能力。这项成就提供了一个以前未实现的机会，以保持源自健康供体的祖细胞的持久供应，以分化为用于基于细胞和分子的研究的人原发性气道上皮。此外，基底干细胞可以从患有特定气道疾病的患者（例如囊性纤维化）中收集，从而能够在适当的气道粘膜环境下研究疾病特异性细胞的潜在改变的行为。在这里，我们详细描述了一系列气道基底干细胞系列扩增的方案，以实现几乎无限制的气道基底细胞的生成，这些细胞可以储存并随时用于随后的培养和分化。此外，我们描述了气液基底干细胞在空气 - 液体界面处的可渗透Transwell过滤器上的培养和分化，以创建功能性粘膜睫毛伪分层极化气道上皮粘膜。
【背景】气道疾病建模和药物发现已经从在气液界面（ALI）的可渗透Transwell过滤器上生长的原代呼吸道上皮培养物的开发和使用中获益。与永生化细胞系相比，该模型具有几个优点，即原代上皮细胞可以分化成具有多种上皮细胞类型（包括纤毛，浆膜和基底细胞）的气道粘膜，并且它们的排列在体内是相当反映的蜂窝组织。主要的ALI模型表现出功能性微生理过程，包括跳动纤毛和分泌粘液的能力，这些特征在细胞系衍生的上皮单层中显着不存在。此外，原代细胞不依赖于人工永生化或转化，因为细胞系来源的上皮细胞确实存在，因此不受细胞系中可能发生的错误信号传导的阻碍，这可能会错误地表示气道上皮中发生的过程。尽管有这些显着的限制，永生化细胞系被广泛用于模拟和研究气道上皮细胞，因为原发性气道上皮细胞存在自己的一系列挑战。原代上皮细胞在传代数次后无法复制，必须连续收获并分离以完成每组研究。另外，改变或缺失感兴趣基因表达的分子生物学技术难以实现，并且与原代上皮细胞一起维持。这些缺点造成成本和技术障碍，阻碍了原发性ALI培养物的广泛使用，尽管它们在调查气道粘膜方面有明显优势。 ...
|
|
|
| GFP-Grb2 Translocation Assay Using High-content Imaging to Screen for Modulators of EGFR-signaling
|
|
Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] High-content screening is a useful tool to understand complex cellular processes and to identify genes, proteins or small molecule compounds that modulate such pathways. High-content assays monitor the function of a protein or pathway by visualizing a change in an image-based readout, such as a change in the localization of a reporter protein. Examples of this can be the translocation of a fluorescently tagged protein from the cytoplasm to the nucleus or to the plasma membrane. One protein that is known to undergo such translocation is the Growth Factor Receptor-bound protein 2 (GRB2) that is ...
[摘要] 高含量筛选是了解复杂细胞过程和鉴定调节这种途径的基因，蛋白质或小分子化合物的有用工具。高含量测定法通过显现基于图像的读数的变化来监测蛋白质或途径的功能，例如报告蛋白的定位的变化。其实例可以是将荧光标记的蛋白质从细胞质转移到细胞核或质膜。已知发生这种易位的一种蛋白质是生长因子受体结合蛋白2（GRB2），其在刺激生长因子受体并且随后经历内化后被招募到质膜。我们以前用GFP标记的Grb2来鉴定涉及EGFR信号的基因（Petschnigg等，2017）。最终，该测定可以适应于cDNA表达克隆（Freeman等人，2012），并且可用于早期药物发现以鉴定调节或抑制EGFR信号传导和内化的化合物（Antczak和Djaballah，2016）。
【背景】生长因子受体的信号转导对细胞维持正常功能至关重要，因此需要严格控制。生长因子受体的信号转导通过外部配体（例如，表皮生长因子，EGF）与跨膜受体（例如表皮生长因子受体（EGFR））和下游信号级联的活化（Yao等人，2015 ）。 EGFR-信号传导的关键调节因子是生长因子受体结合蛋白2（Grb2），其由两个SH3结构域的内部SH2（Src同源性2）结构域组成。 Grb2通过其SH2结构域结合磷酸化酪氨酸残基上的活化生长因子受体，从而将受体活化与SOS-Ras-MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号级联偶联。 ...
|
|
|