| Method for Multiplexing CRISPR/Cas9 in Saccharomyces cerevisiae Using Artificial Target DNA Sequences
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Genome manipulation has become more accessible given the advent of the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) editing technology. The Cas9 endonuclease binds a single stranded (single guide) RNA (sgRNA) fragment that recruits the complex to a corresponding genomic target sequence where it induces a double stranded break. Eukaryotic repair systems allow for the introduction of exogenous DNA, repair of existing mutations, or deletion of endogenous gene products. Targeting of Cas9 to multiple genomic positions (termed ‘multiplexing’) is achieved by the expression of ...
[摘要] 鉴于CRISPR（集群定期间隔短回归重复）编辑技术的出现，基因组操纵变得更加易于使用。 Cas9核酸内切酶将募集复合物的单链（单向导）RNA（sgRNA）片段结合到相应的基因组靶序列，引发双链断裂。真核修复系统允许引入外源DNA，修复现有突变或内源基因产物的缺失。通过在同一核内表达多个sgRNA来实现Cas9对多个基因组位置的定位（称为“多重”）。然而，CRISPR领域的持续关注是将Cas9意外地定位到基因组内的替代（“脱靶”）DNA位置。我们将安装的人造Cas9靶序列的使用（称为人造基因座上的Cas9复制）描述为允许（i）与单个sgRNA复用的酵母基因组中的用途; （ii）减少/消除可能的脱靶效应，以及（iii）精确控制预定目标序列的放置。
【背景】CRISPR（集群定期间隔回归重复）机制已经在原核生物中演变为具有很高精度编辑任何基因组的能力的原始适应性免疫系统（Jinek等，2012; Sorek等，2013）。这种生物技术需要使用来自化脓性链球菌（或othologous物种）的内切核酸酶（Cas9），单个RNA'引导'序列和外源供体DNA（如果需要）。仅在短短几年内，CRISPR / ...
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| Determination of (p)ppGpp Levels During Stringent Response in Streptomyces coelicolor by Thin Layer Chromatography
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] The stringent response in bacteria is a stress response that is mediated by the signaling molecules guanosine tetraphosphate and pentaphosphate [(p)ppGpp], alarmones that are also directly related to virulence. Therefore, determination of (p)ppGpp levels is crucial for studying the stringent response. The protocol here outlines in a step-wise manner the detection of (p)ppGpp in the bacterium Streptomyces coelicolor during stringent response (Strauch et al., 1991) by thin layer chromatography (TLC). In the example shown here, stringent response is induced by addition of ...
[摘要] 细菌中的严格反应是由信号分子鸟苷四磷酸和五磷酸[（p）ppGpp]介导的应激反应，它们也与毒力直接相关。因此，（p）ppGpp水平的确定对于研究严格反应至关重要。这里的方案以分步方式概述在严格反应期间细菌链霉菌（Streptomyces coelicolor）中（p）ppGpp的检测（Strauch等人，1991），通过薄层色谱（TLC）。在本文所示的实施例中，通过添加丝氨酸氧肟酸盐（丝氨酸tRNA合成酶的抑制剂）诱导严格反应。该方案首次发表于Molecular Microbiology（Sivapragasam and Grove，2016）。
[背景] 薄层色谱法用于在严格反应期间分析（p）ppGpp水平在各种细菌菌种中长时间使用，并且它是用于该目的的普遍接受的方法。然而，以前发布的协议仅仅总结了主要概念，并且确定包括该过程的每个步骤的综合协议是具有挑战性的。我们在这里提出已经优化用于研究在严格的反应的详细协议。 coelicolor 。处理 S唯一的步骤。天蓝色文化已经被鉴定，并且因此方案可以容易地适应于其他细菌物种。该方法依赖于使用并入作为强碱性阴离子交换剂的聚乙烯亚胺（PEI）的TLC板。因此，PEI是用于分离离子化合物如磷酸化核苷的选择的基质（Calderón-Flores等人，2005; Mechold等人，2013; Strauch ...
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