| Bacterial Microcolonies in Gel Beads for High-throughput Screening
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] High-throughput screening of a DNA library expressed in a bacterial population for identifying potentially rare members displaying a property of interest is a crucial step for success in many experiments such as directed evolution of proteins and synthetic circuits and deep mutational scanning to identify gain- or loss-of-function mutants.
Here, I describe a protocol for high-throughput screening of bacterial (E. coli) microcolonies in gel beads. Single cells are encapsulated into monodisperse water-in-oil emulsion droplets produced with a microfluidic device. The aqueous ...
[摘要] 在细菌群体中表达的DNA文库的高通量筛选用于鉴定显示感兴趣性质的潜在稀有成员是在许多实验中成功的关键步骤，例如蛋白质和合成回路的定向进化以及用于鉴定增益的深度突变扫描 - 或功能丧失的突变体。
在这里，我描述了一种用于高通量筛选凝胶珠中细菌（大肠杆菌）微菌落的方案。将单细胞包封成用微流体装置产生的单分散油包水乳液液滴。水溶液还含有琼脂糖，其在冰上冷却时凝胶化，从而在液滴内部形成固体凝胶珠。在乳液温育期间，细胞在珠内生长成单克隆微菌落。在从乳液中分离凝胶珠并通过荧光激活细胞分选（FACS）分选后，从凝胶珠中回收细菌，然后准备进行进一步的分选，诱变或分析。为了通过FACS分类，该方案需要荧光读数，例如荧光报告蛋白的表达。测量微小菌落的平均荧光信号降低了高表型细胞间变异性的影响，并且与单细胞分选相比提高了灵敏度。我们应用这种方法在ON和OFF状态下对pBAD启动子文库进行分类（Duarte et al。，2017）。
【背景】荧光激活细胞分选（FACS）具有> 10 7 事件/ h的无与伦比的筛选通量（Davies，2012）。然而，通过FACS根据其荧光分选单个细胞以筛选合成回路的文库（Schaerli和Isalan，2013）经常受到高表型细胞间变异性的阻碍。或者，可以对水凝胶珠中所含的小细胞集落（微集落）进行分类（Weaver ...
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| FRAP: A Powerful Method to Evaluate Membrane Fluidity in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) is probably the most direct method to investigate the dynamics of molecules in living cells. Here, we describe FRAP to quantify membrane fluidity in C. elegans. Using FRAP, we have shown that cold, glucose and exogenous saturated fatty acids can decrease the fluidity of cellular membranes in certain mutants.
[摘要] FRAP（光漂白后的荧光恢复）可能是研究活细胞中分子动力学的最直接方法。 在这里，我们描述FRAP来量化 C中的膜流动性。线虫。 使用FRAP，我们已经表明冷，葡萄糖和外源饱和脂肪酸可以降低某些突变体中细胞膜的流动性。
【背景】生物膜，定义所有细胞的特征，主要由磷脂组成（Van Meer 等人，，2008）。存在于磷脂双层中的脂肪酸物质极大地影响其性质。例如，高饱和脂肪酸含量增加了膜的刚性，而高不饱和脂肪酸含量促进了流动性（Pilon，2016）。细胞膜的脂肪酸组成通常与膳食脂肪的组成明显相关，膳食脂肪可直接掺入磷脂中（Abbott et al。，2012; Dancy et al。，2015）。然而，考虑到饮食中存在广泛的变化，细胞必须具有调节机制，监测和调节膜组成并获得所需的膜性质，例如流动性，曲率，厚度，等等。使用FRAP对在肠道细胞中表达prenylated GFP的蠕虫，我们先前已经证明，缺乏PAQR-2（哺乳动物脂联素受体的同源物）的突变体在葡萄糖或富含饱和脂肪的饮食中培养时降低了膜流动性。酸（Svensk et al。，2016; Devkota et ...
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| Analysis of Metals in Whole Cells, Thylakoids and Photosynthetic Protein Complexes in Synechocystis sp. PCC6803
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Date:
2018-06-20
[Abstract] Metals are essential in many biological processes, including oxygenic photosynthesis. Here we described a method to measure the metal pool in whole cells and thylakoids, including the bioactive pool in intact photosynthetic protein complexes in the model oxygenic cyanobacterium Synechocystis PCC6803. In the first part of the protocol, whole cells and thylakoid membranes are carefully prepared, in which the total metal concentrations are measured by inductively coupled plasma triple-quadrupole mass spectrometry (ICP-QQQ-MS). In the second part of the protocol, isolated thylakoids are ...
[摘要] 金属在许多生物过程中是必不可少的，包括含氧光合作用。 在这里我们描述了测量全细胞和类囊体中金属库的方法，包括模型含氧蓝藻PCH6803中完整光合蛋白复合体中的生物活性库。 在方案的第一部分中，仔细制备全细胞和类囊体膜，其中通过电感耦合等离子体三重四极杆质谱（ICP-MS / MS）测量总金属浓度。 在该方案的第二部分，分离的类囊体被溶解以释放完整的膜蛋白和金属结合蛋白复合物。 将这些完整的光合蛋白复合物进行尺寸排阻色谱（SEC），并通过ICP-MS / MS进行连接分析尺寸分离的复合物中的金属结合。
【背景】氧光合作用的过程需要金属，因为它们在光合电子传递链中作为辅因子和催化剂的基本功能。光合装置需要Fe-S簇，血红素桥Fe和非血红素Fe形式的铁（Fe），可溶性移动电子载体蛋白质质体蓝素中的铜（Cu），叶绿素中的镁（Mg）， ...
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