| Analysis of Replicative Intermediates of Adeno-associated Virus through Hirt Extraction and Southern Blotting
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] Adeno-associated virus (AAV) is a small single-stranded DNA virus that requires the presence of a helper virus, such as adenovirus or herpes virus, to efficiently replicate its genome. AAV DNA is replicated by a rolling-hairpin mechanism (Ward, 2006), and during replication several DNA intermediates can be detected. This detailed protocol describes how to analyze the AAV DNA intermediates formed during AAV replication using a modified Hirt extract (Hirt, 1967) procedure and Southern blotting (Southern, 1975).
[摘要] 腺相关病毒（AAV）是一种小型单链DNA病毒，需要存在辅助病毒，如腺病毒或疱疹病毒，以有效地复制其基因组。 AAV DNA通过滚转发夹机制（Ward，2006）进行复制，并且在复制期间可以检测出几种DNA中间体。该详细方案描述了如何使用改良的Hirt提取物（Hirt，1967）程序和Southern印迹（Southern，1975）分析在AAV复制期间形成的AAV DNA中间体。
背景 AAV DNA复制通过滚动发夹机制在由AAV和辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒共感染的细胞中进行（Ward，2006）。 AAV DNA由4.7kb的线性DNA分子和倒置的末端重复（ITR）组成，折叠形成T形发夹结构。 3'末端发夹作为AAV DNA复制的引物。这些发夹结构由AAV Rep蛋白再生，允许进一步复制（Im和Muzyczka，1990）。 AAV DNA的+和 - 链都被包装并且是感染性的（Rose等人，1969）。当分析复制AAV DNA时，可以检测到几种复制中间体（Straus等人，1976）。最丰富的复制中间体是由AAV DNA的一个和一个链形成的线性单体双链体分子，其被认为是将包装在预先形成的衣壳中的后代单链分子的直接前体（Straus ，1976）。二聚体复制中间体也是常见的，AAV复制模型与甚至更大的复制中间体相容。 ...
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| Dot Blot Analysis of N6-methyladenosine RNA Modification Levels
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Author:
Date:
2017-01-05
[Abstract] N6-methyladenosine (m6A) is the most prevalent internal modification of eukaryotic messenger RNA (mRNA). The total amount of m6A can be detected by several methods, such as dot blot analysis using specific m6A antibodies and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) (Fu et al., 2014; Shen et al., 2016). Here we describe the method for fast detection of total m6A levels in mRNA by dot blot analysis using a specific m6A antibody.
[摘要] N 6 - 甲基腺苷（m 6）是真核信使RNA（mRNA）的最普遍的内部修饰。可以通过几种方法检测m 6的总量，例如使用特异性m 5抗体的斑点印迹分析和定量液相色谱 - 串联质谱（LC- MS / MS）（Fu等人，2014; Shen等人，2016）。在这里，我们描述使用特异性m 5抗体通过斑点印迹分析来快速检测mRNA中的总m 6 A水平的方法。
背景 与其他方法（如二维薄层色谱和LC-MS / MS）相比，mRNA检测的斑点印迹分析相对容易，快速，经济有效。这种方法可以以定性的方式用于评估在不同发育阶段的各种植物组织或植物中的m A水平的时间和空间变化。这对于通过其他复杂和定量方法进行详细调查之前初步检查相关突变体中m A水平的变化特别有用。
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| In vitro Drug Susceptibility Assay for HBV Using Southern Blotting
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Author:
Date:
2015-04-20
[Abstract] Antiviral agents for the suppression of hepatitis B virus (HBV) have been used for treating chronic hepatitis B. However, the emergence of drug-resistant HBV is still a major problem for antiviral treatment. To identify and characterize the drug-resistant HBV, the construction of HBV replicon and in vitro drug susceptibility assay are essential. Here we describe the experimental methods to study drug-resistant HBV.
[摘要] 用于抑制乙型肝炎病毒（HBV）的抗病毒剂已经用于治疗慢性乙型肝炎。然而，耐药性HBV的出现仍然是抗病毒治疗的主要问题。 为了鉴定和表征耐药性HBV，构建HBV复制子和体外药物敏感性测定是必需的。 在这里我们描述研究耐药性HBV的实验方法。
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