| Bacterial Microcolonies in Gel Beads for High-throughput Screening
|
|
Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] High-throughput screening of a DNA library expressed in a bacterial population for identifying potentially rare members displaying a property of interest is a crucial step for success in many experiments such as directed evolution of proteins and synthetic circuits and deep mutational scanning to identify gain- or loss-of-function mutants.
Here, I describe a protocol for high-throughput screening of bacterial (E. coli) microcolonies in gel beads. Single cells are encapsulated into monodisperse water-in-oil emulsion droplets produced with a microfluidic device. The aqueous ...
[摘要] 在细菌群体中表达的DNA文库的高通量筛选用于鉴定显示感兴趣性质的潜在稀有成员是在许多实验中成功的关键步骤，例如蛋白质和合成回路的定向进化以及用于鉴定增益的深度突变扫描 - 或功能丧失的突变体。
在这里，我描述了一种用于高通量筛选凝胶珠中细菌（大肠杆菌）微菌落的方案。将单细胞包封成用微流体装置产生的单分散油包水乳液液滴。水溶液还含有琼脂糖，其在冰上冷却时凝胶化，从而在液滴内部形成固体凝胶珠。在乳液温育期间，细胞在珠内生长成单克隆微菌落。在从乳液中分离凝胶珠并通过荧光激活细胞分选（FACS）分选后，从凝胶珠中回收细菌，然后准备进行进一步的分选，诱变或分析。为了通过FACS分类，该方案需要荧光读数，例如荧光报告蛋白的表达。测量微小菌落的平均荧光信号降低了高表型细胞间变异性的影响，并且与单细胞分选相比提高了灵敏度。我们应用这种方法在ON和OFF状态下对pBAD启动子文库进行分类（Duarte et al。，2017）。
【背景】荧光激活细胞分选（FACS）具有> 10 7 事件/ h的无与伦比的筛选通量（Davies，2012）。然而，通过FACS根据其荧光分选单个细胞以筛选合成回路的文库（Schaerli和Isalan，2013）经常受到高表型细胞间变异性的阻碍。或者，可以对水凝胶珠中所含的小细胞集落（微集落）进行分类（Weaver ...
|
|
|
| Detection of Protein Interactions in the Cytoplasm and Periplasm of Escherichia coli by Förster Resonance Energy Transfer
|
|
Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] This protocol was developed to qualitatively and quantitatively detect protein-protein interactions in Escherichia coli by Förster Resonance Energy Transfer (FRET). The described assay allows for the previously impossible in vivo screening of periplasmic protein-protein interactions. In FRET, excitation of a donor fluorescent molecule results in the transfer of energy to an acceptor fluorescent molecule, which will then emit light if the distance between them is within the 1-10 nm range. Fluorescent proteins can be genetically encoded as fusions to proteins of interest and ...
[摘要] 该协议的开发是通过Förster共振能量转移（FRET）定性和定量检测大肠杆菌中的蛋白质 - 蛋白质相互作用。所描述的测定允许以前不可能的周质蛋白质 - 蛋白质相互作用的体内筛选。在FRET中，供体荧光分子的激发导致能量转移到受体荧光分子，如果它们之间的距离在1-10nm范围内，则受体荧光分子将发光。荧光蛋白质可以被遗传编码为与感兴趣的蛋白质的融合物并且在细胞中表达，因此FRET蛋白质 - 蛋白质相互作用实验可以在体内进行。供体和受体荧光蛋白融合体被构建用于被怀疑相互作用的细菌蛋白质。这些融合蛋白在细菌细胞中共表达，随后激发供体和受体通道测量荧光发射光谱。供体的发射光谱与受体的激发光谱之间的部分重叠是FRET的先决条件。即使在没有FRET的情况下，供体激发也可以使受体以已知百分比交叉激发。通过测量背景，仅供体和仅受体样品的参考光谱，可以计算预期的发射光谱。在预期光谱之上的受体的致敏发射可以归因于FRET，并且可以通过光谱解混来量化。
【背景】确定如何和哪些蛋白质相互作用维持生命是分子生物学研究的核心。存在许多体外方法，但可能导致误报，因为相互作用是从其生物学背景中取出的。 ...
|
|
|
| Assay to Access Anthelmintic Activity of Small Molecule Drugs Using Caenohabidtis elegans as a Model
|
|
Author:
Date:
2017-01-20
[Abstract] This protocol proposes to use the nematode Caenorhabditis elegans as a model to screen and study the anthelmintic activity of natural and synthetic compounds and to observe their effects on the morphology and the ultrastructure of the helminths. Furthermore, C. elegans can be used to investigate the anthelmintic activity in embryonated eggs, larval stages and in the adults’ survival. As most current anthelmintics are not effective against all nematode life stages, this protocol can contribute to the identification of new alternatives to helminthic infections (Sant’Anna et ...
[摘要] 该方案建议使用线虫秀丽隐杆线虫作为模型来筛选和研究天然和合成化合物的驱虫活性，并观察其对趾甲的形态和超微结构的影响。此外，C。线虫可用于研究胚胎卵，幼虫期和成年人生存期的驱虫活性。由于目前的大多数驱虫药对所有的线虫生命阶段均无效，因此该方案可有助于确定蠕虫感染的新替代品（2016年Sant'Anna等人）。
背景 秀丽隐杆线虫是寄生线虫研究的典型生物，是具有潜在驱虫活性的化合物筛选的优良系统，因为它便宜，易于获得并且易于使用。另外，使用 C。线虫在调查线虫行为，运动，繁殖和死亡的测定中是不复杂和可靠的（Simpkin和Coles，1981）。用于筛选新化合物的方案。首先在深孔显微镜载玻片（Tomlinson等人，1985）中的无菌液体培养基中进行线虫，或使用加入熔融修饰的NGM琼脂中的药物（Driscoll等人，1989）。这些方法在药物筛选中无效，因为含有低食物供应的无菌培养物，引发子宫内出生导致产妇死亡（“内毒素”）（Lenaerts等人） 2008），添加到熔化琼脂中的药物可以改善由于高温导致的药物稳定性。在该方案中，我们使用96孔平板与大肠杆菌供应的液体培养基独立地评估每个阶段（卵，L1-L2幼虫，L3-L4幼虫和成年人）。
|
|
|