| SDS-PAGE for Silk Fibroin Protein
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] The method and detailed procedure of SDS-PAGE for silk proteins are exactly the same as for other proteins, but the electrophoresis profile of silk protein is often unsatisfactory. The main reason is that their molecular masses are too large, and the regenerated liquid silk is easily coagulated and denatured, resulting in a significant adverse effect on normal electrophoresis. A satisfactory SDS-PAGE profile for silk protein can be obtained by rapidly loading samples, reducing time and temperature when mixing the sample with the loading dye.
[摘要] 丝蛋白的SDS-PAGE方法和详细步骤与其他蛋白质完全相同，但丝蛋白的电泳图谱往往不能令人满意。 主要原因是它们的分子量太大，再生的液体丝很容易凝固和变性，导致对正常电泳的显着不利影响。 通过快速加载样品，在将样品与上样染料混合时减少时间和温度，可以获得令人满意的丝蛋白SDS-PAGE图谱。
【背景】蛋白质或多肽的SDS-PAGE是分析蛋白质亚基分子量的最经典，基本和常用的实验方法之一（Laemmli，1970）。因此，对于大多数蛋白质而言，通常不难获得具有清晰条带的良好SDS-PAGE电泳图谱。
然而，对于参与丝蛋白电泳实验的研究人员来说，似乎不容易获得具有清晰的轻链带（一种丝素蛋白亚基）的良好SDS-PAGE图谱。对于没有长时间电泳经验的初学者或学生来说尤其如此。问题出在哪儿？主要困难与SDS-PAGE技术本身无关，但与丝纤维制备液体丝素蛋白有关，以及丝素蛋白本身的独特性质。
丝蛋白是丝素蛋白和丝胶蛋白的总称。由成熟的家蚕幼虫纺成的两条平行单丝由65％-75％的丝心蛋白，20％-30％的丝胶蛋白和5％的蜡，色素，糖和其他杂质组成。丝素蛋白是一种结晶聚合物基纤维，被几层胶质蛋白包围。丝胶蛋白的最外层易溶于热水或沸水中。最接近丝心蛋白纤维的最内层丝胶蛋白几乎不溶于沸水（Wang和Zhang，2011）。所有分层的丝胶蛋白都易于溶解在碱性热水或沸水中。因此，在实验室中最常使用0.1％-0.5％Na ...
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| Expression and Ni-NTA-Agarose Purification of Recombinant Hepatitis C Virus E2 Ectodomain Produced in a Baculovirus Expression System
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] In this protocol, we describe the production and purification of the ectodomain of the E2661 envelope protein (amino acids 384-661) of the Hepatitis C virus, which plays a fundamental role in the entry of the virus into the host cell. This protein has been expressed in both prokaryotic and eukaryotic systems but in small quantities or without native protein characteristics. In our case, we use the Baculovirus expression system in insect cells. E2661 is secreted into the extracellular medium and purified by means of affinity chromatography a Ni-NTA-column because the ...
[摘要] 在该协议中，我们描述了丙型肝炎病毒的E2 661 包膜蛋白（氨基酸384-661）的胞外域的产生和纯化，其在病毒进入中起基础作用。 进入宿主细胞。 该蛋白质已经在原核和真核系统中表达，但是少量或没有天然蛋白质特征。 在我们的例子中，我们在昆虫细胞中使用杆状病毒表达系统。 E2 661 被分泌到细胞外培养基中并通过亲和层析Ni-NTA-柱纯化，因为该蛋白质在其氨基末端具有六个组氨酸的标签。 纯化的蛋白质具有天然样构象，并且大量生产，每升约5-6mg。
【背景】丙型肝炎病毒（HCV）是全世界慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌的主要原因（Major et al。，2001; Alter，2006）。此时，没有HCV疫苗，抗病毒药物用于治疗HCV感染（Imran et al。，2014）。然而，治疗费用昂贵且不是100％有效（Kohli et al。，2014）。 HCV包膜糖蛋白E2负责与细胞受体的相互作用，因此它是研究病毒感染周期的第一步的主要候选者。由于糖基化和聚集，先前的表达系统产生低水平的异质蛋白质，并且难以区分经历生产性和非生产性折叠的分子（Flint ...
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| Detection of Catalase Activity by Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) in Cell Extracts from Pseudomonas aeruginosa
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Bacteria in nature and as pathogens commonly face oxidative stress which causes damage to proteins, lipids and DNA. This damage is produced by the action of reactive oxygen species (ROS) such as hydrogen peroxide (H2O2), singlet oxygen, superoxide anion and hydroxyl radical. ROS are generated by antimicrobials, environmental factors (e.g., ultraviolet radiation, osmotic stress), aerobic respiration, and host phagocytes during infective processes. Pseudomonas aeruginosa, a versatile bacterium, is a prevalent opportunistic human pathogen which possesses ...
[摘要] 自然界中的细菌和病原体通常会面临氧化应激，导致蛋白质，脂质和DNA的损伤。 这种损害是由活性氧（ROS）如过氧化氢（H 2 O 2 2），单线态氧，超氧阴离子和羟基自由基的作用产生的。 ROS在感染过程中由抗菌剂，环境因素（例如，紫外线辐射，渗透压力），有氧呼吸和宿主吞噬细胞产生。 铜绿假单胞菌是一种多功能细菌，是一种普遍的机会性人类病原体，其具有针对ROS的几种防御策略。 其中，两种过氧化氢酶（KatA和KatB）在防御多种类型的压力方面的作用得到了很好的表征。 在该协议中，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测KatA和KatB活性。 还有人认为KatB的检测是难以捉摸的。
【背景】 P上。铜绿假单胞菌是一种无处不在的细菌，它可以以游离形式在陆地和水生栖息地中发现，或作为机会性人类病原体在免疫功能低下的个体，皮肤损伤或囊性纤维化患者中引起致命性感染。为了抵御其有氧代谢产生的ROS，寄主吞噬泡和环境因素，这种微生物具有多种抗氧化策略。其中，两个单功能的过氧化氢酶（KatA和KatB）负责将H 2 O分解成水和O 2。 KatA是主要的过氧化氢酶并具有独特的特征：它对H 2 O 2抗性，渗透保护和毒力非常稳定并且是必不可少的（Hassett等人 2000; Lee等人，2005）。有人认为，KatA的稳定性是正常生长条件下高水平活性的主要因素之一，因此， ...
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