Studying the Role of Microglia in Neurodegeneration and Axonal Regeneration in the Murine Visual System
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Microglia reside in the central nervous system (CNS) and are involved in the maintenance of the physiologic state. They constantly survey their environment for pathologic alterations associated with injury or diseases. For decades, researchers have investigated the role of microglia under different pathologic conditions, using approaches aiming to inhibit or eliminate these phagocytic cells. However, until recently, methods have failed to achieve complete depletion. Moreover, treatments often affected other cells, making unequivocal conclusions from these studies difficult. Recently, we have ...
[摘要] 小胶质细胞存在于中枢神经系统(CNS)中,并参与维持生理状态。他们不断调查他们的环境,以寻找与受伤或疾病相关的病理改变。几十年来,研究人员使用旨在抑制或消除这些吞噬细胞的方法,研究了小胶质细胞在不同病理条件下的作用。然而,直到最近,方法未能实现完全耗尽。此外,治疗通常会影响其他细胞,因此难以从这些研究中得出明确的结论。最近,我们已经表明,通过用含有食物的PLX5622口服治疗抑制集落刺激因子1受体(CSF1R)能够完全消除视网膜小胶质细胞并且几乎完全消除视神经中的小胶质细胞,而不影响外周巨噬细胞或其他细胞。使用这种方法,我们研究了小胶质细胞在视网膜神经保护中的作用以及在不同条件下受损视神经中的轴突再生。因此,这里提出的这种有效,可靠和易于使用的方案将使研究人员能够明确地研究小胶质细胞对神经变性和轴突再生的贡献。该方案还可以容易地扩展到视觉系统中的急性和慢性损伤或疾病的其他范例。
【背景】 小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的常驻免疫细胞,其持续扫描其环境以进行病理改变(Nimmerjahn et al。,2005)。在检测到这种情况后,小胶质细胞转变为活化状态并向其进行不同任务的来源迁移(Kreutzberg,1996; Davalos et ...
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Cell-free Generation of COPII-coated Procollagen I Carriers
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] The aim of this protocol is to generate COPII-coated procollagen I (PC1) carriers in a cell-free reaction. The COPII-coated PC1 carriers were reconstituted from donor membrane, cytosol, purified recombinant COPII proteins, and nucleotides. This protocol describes the preparation of donor membrane and cytosol, the assembly of the reaction, and the isolation and detection of reconstituted COPII-coated carriers. This cell-free reaction can be used to test conditions that stimulate or suppress the packaging of PC1 into COPII-coated carriers.
[摘要] 该协议的目的是在无细胞反应中产生COPII包被的前胶原I(PC1)载体。 COPII包被的PC1载体由供体膜,胞质溶胶,纯化的重组COPII蛋白和核苷酸重构。 该方案描述了供体膜和细胞溶胶的制备,反应的组装,以及复制的COPII包被的载体的分离和检测。 该无细胞反应可用于测试刺激或抑制PC1包装成COPII包被的载体的条件。 【背景】外壳蛋白复合体II(COPII)在从内质网(ER)途径到高尔基体的运输中起着至关重要的作用。来自ER的货物运输所需的基因在酵母的基因研究中被发现,并且借助于添加有纯化组分的无细胞囊泡萌芽反应来阐明囊泡出芽所需基因的蛋白质产物的精确作用(Novick 1981; Kaiser等人,1990; Barlowe等人,1994)。开发了类似的反应来检测COPII在培养的哺乳动物细胞中来自ER的货物运输中的作用(Kim等人,2005)。哺乳动物COPII包被的囊泡直径大约为80-100nm,似乎太小以至于不能容纳诸如刚性的300nm前胶原I(PC1)三股螺旋杆的大分泌性货物。尽管可能的尺寸差异,COPII对于包括PC1在内的大型货物的分泌是必不可少的(Boyadjiev等人,2006)。最近,我们报道了通过随机光学重建显微镜(STORM),相关光电子显微镜(CLEM)和活细胞成像(Gorur ...
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Non-radioactive LATS in vitro Kinase Assay
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Date:
2017-07-20
[Abstract] This protocol describes a method to directly measure LATS activity by an in vitro kinase assay using YAP as a substrate.
[摘要] 该方案描述了通过使用YAP作为底物的体外激酶测定直接测量LATS活性的方法。 【背景】大肿瘤抑制剂1/2(LATS1 / 2)是河马途径的蛋白激酶和核心成分,其调节器官大小和组织稳态。 LATS激酶通过其疏水基序上的磷酸化被激活(HM,对于LATS1为Thr 1079,对于LATS2为Thr 1041)。 结果,在HM中识别LATS的抗体抗体的Western印迹提供了评估LATS激酶活性的间接方法(Data analysis,图1)。 此外,活性LATS在Ser 127磷酸化并抑制转录共激活物是相关蛋白(YAP),导致YAP结合到14-3-3和细胞质保留(Zhao等人,2007)。 在LATS体外激酶测定中使用YAP作为底物提供了直接评估LATS激酶活性的方法。 通过该测定,我们能够显示血清饥饿和山梨醇诱导的渗透激活LATS(Yu等人,2012; Hong等人,2017)和进一步的 导致YAP Ser 127磷酸化(数据分析,图2)。
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