| High Throughput NPY-Venus and Serotonin Secretion Assays for Regulated Exocytosis in Neuroendocrine Cells
|
|
Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Here we describe two assays to measure dense core vesicle (DCV) exocytosis-mediated cargo secretion in neuroendocrine cells. To conduct siRNA screens for novel genes in regulated DCV exocytosis, we developed a plate reader-based secretion assay using DCV cargo, NPY-Venus, and an orthogonal 3H-serotonin secretion assay. The NPY-Venus secretion assay was successfully used for a high throughput siRNA screen, and the serotonin secretion assay was used to validate hits identified from the screen (Sorensen, 2017; Zhang et al., 2017).
[摘要] 在这里我们描述了两种测定方法来测量神经内分泌细胞中的致密核心囊泡（DCV）胞吐作用介导的货物分泌。 为了在受调控的DCV胞吐作用中对新基因进行siRNA筛选，我们开发了使用DCV货物，NPY-金星以及正交3H-血清素分泌测定的基于读板器的分泌测定法。 NPY-金星分泌测定成功地用于高通量siRNA筛选，并且使用血清素分泌测定来验证从筛选中鉴定的命中（Sorensen，2017; Zhang等人，2017）。
【背景】致密核心囊泡（DCV）胞吐作用介导内分泌和神经内分泌细胞分泌蛋白质，肽和小分子。当蛋白质和肽激素被内质网上的核糖体合成时，蛋白质和肽激素进入分泌途径，并在跨高尔基网络（TGN）（Borgonovo等人，2006; Bowman等， >等人，2009）。小分子物质，如5-羟色胺，直接被胞质单胺转运蛋白（VMATs）从细胞质直接吸收到DCV的内腔（Sudhof，2004）。在非刺激条件下，货物分子被储存在靠近质膜的DCV内。当细胞接受增加细胞质Ca ...
|
|
|
| An Affinity-directed Protein Missile (AdPROM) System for Targeted Destruction of Endogenous Proteins
|
|
Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] We recently reported an Affinity-directed PROtein Missile (AdPROM) system for the targeted proteolysis of endogenous proteins of interest (POI) (Fulcher et al., 2016 and 2017). AdPROM consists of the Von Hippel Lindau (VHL) protein, a Cullin 2 E3 ligase substrate receptor (Bosu and Kipreos, 2008), conjugated to a high affinity polypeptide binder (such as a camelid nanobody) that recognises the target protein in cells. When introduced in cells, the target protein is recruited to the CUL2 E3 ubiquitin ligase complex for ubiquitin-mediated proteasomal degradation. For target protein ...
[摘要] 我们最近报道了一种针对内源性感兴趣蛋白（POI）的靶向蛋白水解的亲和指导PROtein导弹（AdPROM）系统（Fulcher等人，2016和2017）。 AdPROM由Von Hippel Lindau（VHL）蛋白组成，Cullin 2 E3连接酶底物受体（Bosu and Kipreos，2008），与识别细胞中靶蛋白的高亲和力多肽结合剂（如骆驼科纳米抗体）缀合。当在细胞中引入时，靶蛋白质被招募到CUL2 E3泛素连接酶复合体用于泛素介导的蛋白酶体降解。对于靶蛋白的募集，我们使用了基于人类III型纤连蛋白结构域的骆驼科动物来源的VHH结构域纳米抗体以及合成多肽单体（Sharm等人，2013; Fridy等人。，2014; Schmidt et al。，2016）。在此协议中，我们描述了生成AdPROM构建体及其在人细胞系中用于靶蛋白质破坏的详细方法。 AdPROM允许对POI进行功能表征，并且其目标蛋白质破坏的效率克服了RNA干扰方法的许多局限性，这些方法需要长时间的治疗并与脱靶效应相关联，而CRISPR / Cas9基因编辑并不总是可行的。
【背景】该协议使人们能够在哺乳动物细胞系中设计，构建和表达AdPROM VHL-nano ...
|
|
|
| Lentiviral shRNA Screen to Identify Epithelial Integrity Regulating Genes in MCF10A 3D Culture
|
|
Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] MCF10A 3D culture system provides a reductionist model of glandular mammary epithelium which is widely used to study development of glandular architecture, the role of cell polarity and epithelial integrity in control of epithelial cell functions, and mechanisms of breast cancer. Here we describe how to use shRNA screening approach to identify critical cell pathways that couple epithelial structure to individual cell based responses such as cell cycle exit and apoptosis. These studies will help to interrogate genetic changes critical for early breast tumorigenesis. The protocol describes a ...
[摘要] MCF10A 3D文化系统提供了腺体乳腺上皮的还原剂模型，其广泛用于研究腺体结构的发育，细胞极性和上皮完整性在上皮细胞功能的控制中的作用以及乳腺癌的机制。在这里我们描述如何使用shRNA筛选方法来识别关键细胞通路，夫妇上皮结构到个别细胞的反应，如细胞周期退出和凋亡。这些研究将有助于询问对早期乳腺肿瘤发生至关重要的遗传变化。该协议描述了设计用于靶向上皮完整性的慢病毒shRNA构建体的文库和用于悬浮MCF10A培养物的慢病毒转导的高效方法。此外，提供的协议设置MCF10A 3D文化在Matrigel的形态和细胞反应研究通过结构化照明和共聚焦显微镜分析免疫染色的三维结构。
关键字： 3D文化，MCF10A，shRNA，上皮完整性，免疫荧光染色，3D成像，形态测量分析
[背景] 上皮细胞形成高度组织的组织结构，其提供物理支持和用于协调细胞信号传导的结构化支架。跨上皮结构的这种协调的信号传导对于上皮生物学是基本的;使得上皮细胞在调节器官大小，形状，功能和基于个体细胞的应答中的动态联合作用（Roignot等人，2013; Shamir和Ewald，2014）。上皮信号传导的联合指挥还提供了一种强有力的肿瘤抑制机制，通过将外部和内部有丝分裂信号门控到静止的上皮组织（Partanen等人，2013; Rejon等人 ...
|
|
|