| Preparation of Sequencing RNA Libraries through Chemical Cross-linking Coupled to Affinity Purification (cCLAP) in Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Ribonucleoprotein particles (mRNPs) are complexes consisting of mRNAs and RNA-binding proteins (RBPs) which control mRNA transcription localization, turnover, and translation. Some mRNAs within the mRNPs have been shown to undergo degradation or storage. Those transcripts can lack general mRNA elements, like the poly(A) tail or 5’ cap structure, which prevent their identification through the application of widely-used approaches like oligo(dT) purification. Here, we describe a modified cross-linking affinity purification protocol (cCLAP) based on existing cross-linking and immunoprecipitation ...
[摘要] 核糖核蛋白颗粒（mRNP）是由mRNA和RNA结合蛋白（RBP）组成的复合物，其控制mRNA转录定位，转换和翻译。已显示mRNP内的一些mRNA经历降解或储存。那些转录物可能缺乏一般的mRNA元件，如poly（A）尾或5'帽结构，这通过应用广泛使用的方法如oligo（dT）纯化来阻止它们的鉴定。在这里，我们描述了基于现有的交联和免疫沉淀（CLIP）方法的修饰的交联亲和纯化方案（cCLAP），以分离mRNP中可被去腺苷酸化，去除和/或部分降解的mRNA，从而开启了检测不同的可能性。非编码RNA（ncRNA）的类型。分离后，将RNA进行衔接子连接，然后进行下一代测序（NGS）。由于快速有效的交联和淬灭步骤，该方案也适用于瞬时诱导的mRNP颗粒。实例包括由外在应激物触发的处理体（PB）或应力颗粒（SG）。其重现性和广泛应用使该方案成为研究特定RNP的RNA组成的有用且有力的工具。
【背景】mRNP内转录物的表征对于理解细胞转录和转录后过程至关重要。通过交联和免疫沉淀，然后通过RNA-Seq从mRNP颗粒中分离RNA已经成为鉴定mRNA靶标的常用方法（Tagwerker et al。，2006; Hafner et al。，2010; Kishore et al。，2011）。 ...
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| Detection of Apoptosis-like Cell Death in Ustilago maydis by Annexin V-FITC Staining
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Programmed cell death (PCD) guides the transition between key developmental stages in many organisms. PCD also remains an important fate for many organisms upon exposure to different stress conditions. Therefore, an insight into the progression of PCD during the execution of a biological phenomenon can yield significant details of the underlying mechanism. Apoptosis, as well as apoptosis-like programmed cell death, constitutes one of the forms of PCD in higher and lower eukaryotes respectively. Flipping of phosphatidylserine (PS) from the inner leaflet of the plasma membrane to the outer ...
[摘要] 程序性细胞死亡（PCD）指导许多生物体的关键发育阶段之间的过渡。 PCD在暴露于不同的胁迫条件下仍然是许多生物的重要命运。因此，在执行生物现象期间洞察PCD的进展可以产生潜在机制的重要细节。细胞凋亡以及凋亡样程序性细胞死亡分别构成高等和低等真核生物中PCD的一种形式。将磷脂酰丝氨酸（PS）从质膜的内部小叶翻转到外部小叶是凋亡/凋亡样PCD的不同标志之一，其标志着所述细胞死亡事件的开始。可以使用与PS特异性结合的膜联蛋白V-FITC通过染色靶细胞来检测这种翻转。在 Ustilago maydis 中，由于细胞壁的存在，膜联蛋白V-FITC对外露PS的染色是困难的。因此，这种染色的关键在于，在不显着改变下面的质膜结构/拓扑结构的情况下，温和地去除细胞壁。该协议强调了PS染色对 Ustilago maydis 中应激细胞原生质体的依赖性。
【背景】PS外化是早期可以检测到的凋亡样PCD的标志之一（Martin et al。，1995）。因此，质膜在细胞外膜上的出现标志着凋亡细胞死亡现象的发生。 Ustilago maydis 是一种生物营养植物病原体并感染寄主植物 Zea mays 。 U的生命周期。已证明maydis ...
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| Hypoxia Reporter Element Assay
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Hypoxia is a condition in which there is a decrease in oxygen supply to the cellular environment. Changes to cellular oxygen levels can lead to transcriptional changes of oxygen-regulated genes. Reporter assays are used to study gene expression alteration and modifications in response to environmental changes. Dual-reporter assays allow the simultaneous measurement of two different genes within a single cell, thus improving experimental accuracy. Within this protocol, we describe the utilization of the LightSwitch Dual Assay System to measure BMX expression in response to hypoxic conditions.
[摘要] 缺氧是细胞环境中氧供应减少的一种情况。 细胞氧水平的变化可导致氧调节基因的转录变化。 报告分析用于研究响应环境变化的基因表达改变和修饰。 双报告分析允许同时测量单个细胞内的两个不同基因，从而提高实验准确性。 在该协议中，我们描述了LightSwitch双重测定系统的使用，以测量响应缺氧条件的BMX表达。
【背景】在我们最近的出版物（van Oosterwijk et al。，2018）中，我们试图检测BMX（一种非受体酪氨酸激酶）对索拉非尼治疗的反应。 BMX是一种Tec激酶家族成员，已知与酪氨酸磷酸化蛋白结合并通过与磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸结合而介导膜靶向（PIP3; Chen 等人，2013）。我们发现索拉非尼在有或没有基质细胞支持的急性髓性白血病（AML）细胞系中的直接治疗对BMX的上调没有贡献。以前的研究表明缺血可诱导BMX表达，索拉非尼具有抗血管生成活性（He et al。，2006; Davis et al。，2011）。因此，我们假设索拉非尼的抗血管生成活性导致骨髓内的缺氧环境，从而导致AML中缺氧依赖性BMX上调。在缺氧条件下，我们能够显示许多不同细胞系中BMX表达的显着增加。 BMX启动子的进一步分析在-5005处鉴定出推定的缺氧反应元件（HRE; ...
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