| A Novel Method to Construct Binary CRISPR Vectors for Plant Transformation by Single Round of PCR Amplification
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] CRISPR/Cas9 is an established and flexible tool for genome editing. However, most methods used to generate expression clones for the CRISPR/Cas9 are time-consuming. Hence, we have developed a one-step protocol to introduce sgRNA expression cassette(s) directly into binary vectors (Liu et al., 2020). In this approach, we have optimized the multiplex PCR to produce an overlapping PCR product in a single reaction to generate the sgRNA expression cassette. We also amplified two sgRNA expression cassettes through a single round of PCR. Then, the sgRNA expression cassette(s) is cloned into the ...
[摘要] [摘要] CRISPR / Cas9是一种成熟且灵活的基因组编辑工具。但是，大多数用于生成CRISPR / Cas9表达克隆的方法都很耗时。因此，我们开发了一种将sgRNA表达盒直接引入二元载体的一步协议（Liu等人，2020年）。在这种方法中，我们优化了多重PCR，以在单个反应中产生重叠的PCR产物，从而生成sgRNA表达盒。我们还通过单轮PCR扩增了两个sgRNA表达盒。然后，在Gateway LR或Golden gate反应中将sgRNA表达盒克隆到二元载体中。本文报道的系统为构建用于CRISPR / Cas9介导的基因组编辑的表达克隆提供了更有效，更简单的程序。在此协议中，我们描述了使用此系统的详细分步说明。
[背景]乙acteria保卫针对病毒通过蛋白系统，由群集规则间隔开的短回文重复序列（CRISPR）中，CRISPR相关（CAS）蛋白质，CRISPR的RNA（crRNAs）和反式编码crRNA（tracrRNA）。现在，研究人员已经将其系统开发为用于靶向基因组编辑的关键工具。CRISPR –二元载体表达两个元素–具有靶序列的sgRNA（target-sgRNA）和Cas9蛋白–切割靶基因组区域。冯等人。（2013年）已经构建了网关载体，通过农杆菌介导的转化在植物中共表达Cas9和sgRNA ...
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| A Golden Gate-based Protocol for Assembly of Multiplexed gRNA Expression Arrays for CRISPR/Cas9
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-associated protein 9 (Cas9) has become the most broadly used and powerful tool for genome editing. Many applications of CRISPR-Cas9 require the delivery of multiple small guide RNAs (gRNAs) into the same cell in order to achieve multiplexed gene editing or regulation. Using traditional co-transfection of single gRNA expression vectors, the likelihood of delivering several gRNAs into the same cell decreases in accordance with the number of gRNAs. Thus, we have developed a method to efficiently assemble gRNA expression ...
[摘要] CRISPR（聚簇定期间隔短回文重复序列）相关蛋白9（Cas9）已成为最广泛使用和强大的基因组编辑工具。 CRISPR-Cas9的许多应用需要将多个小导向RNA（gRNA）递送到相同的细胞中以实现多重基因编辑或调节。使用单个gRNA表达载体的传统共转染，将几个gRNA递送到相同细胞中的可能性根据gRNA的数量减少。因此，我们开发了使用Golden-Gate装配方法（Vad-Nielsen等人，2016）将gRNA表达盒（2-30gRNA）有效地装配到一个单一载体中的方法。在这个协议，我们描述详细的分步指示的多路复用gRNA表达式数组的组装。在我们的表达阵列中使用的gRNA支架是由人U6启动子驱动的来自化脓性链球菌的Cas9蛋白的gRNA 1.0系统。
关键字： CRISPR，SpCas9，金门汇编，多重gRNA阵列，同时遗传操作
[背景] ...
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